3.4.1. Tuyển chọn vi khuẩnsinh β-galactosidase
3.4.1.1. Phương pháp hoạt hóa và nuôi cấy giống
Phương pháp hoạt hóa và nuôi cấy giống được tiến hành theo Nguyễn Lân Dũng và cs. (1978) và được mô tả như sau:
- Hoạt hóa lần 1
•Chuẩn bị các ống nghiệm có chứa 5ml môi trường NB (cho vi khuẩn
Bacillus) hoặc môi trường MRS lỏng (cho vi khuẩn lactic) đã hấp khử trùng ở
121oC, 1 atm, trong 15 phút. Dùng đầu que cấy nhọn tiệt trùng lấy khuẩn lạc và cho vào ống nghiệm. Nút miệng ống nghiệm bằng màng bọc thực phẩm, đánh dấu tên chủng, thời gian cấy. Các thao tác thí nghiệm đều được thực hiện trong buồng cấy vi sinh và trên ngọn lửa đèn cồn. Sau đó, các ống nghiệm được chuyển vào tủ nuôi cấy, nuôi ở 37oC, lắc 200 vòng/phút trong vòng 24 giờ.
- Hoạt hóa lần 2
•Tiếp giống 1% từ ống nghiệm hoạt hóa vào bình tam giác chứa môi trường NB (Bacillus) hoặc MRS lỏng (lactic) có bổ sung 1% đường lactose đã hấp khử trùng ở 1210C trong 15 phút. Nuôi cấy ở 37oC, lắc 200 vòng/phút trong 24h.
3.4.1.2. Xác định vi khuẩn sinh β-galactosidase bằng phương pháp Test X-Gal
Chủng vi khuẩn Bacillus/lactic sinh β-galactosidase được xác định theo
sau: β-galactosidase thuỷ phân X-gal hình thành sản phẩm kết tủa màu xanh da trời kiểu indigo. Vì vậy, vi khuẩn dương tính với β-galactosidase sẽ tạo khuẩn lạc màu xanh khi nuôi cấy trên môi trường đĩa thạch bổ sung chỉ thị X-gal và lactose.
- Xác định khả năng sinh enzyme β–galactosidase bằng phương pháp cấy chấm điểm trên đĩa thạch.
+ Môi trường NA bổ sung 1% đường lactose (dùng cho vi khuẩn Bacillus) và môi trường MRS có sử dụng 1% đường lactose (dùng cho vi
khuẩn lactic) được hấp vô trùng và làm nguội, sau đó bổ sung 60 µl X-gal nồng độ 20 mg/ml và 10 µl IPTG 0,1M trên mỗi đĩa, chang đều.
+ Tiến hành cấy chấm điểm chủng vi khuẩn trên mỗi đĩa bằng dịch hoạt hóa.
+ Đĩa cấy vi sinh vật được đưa vào tủ nuôi cấy ở nhiệt độ 37oC, trong điều kiện tối. Kiểm tra kết quả sau 24h, 48h.
3.4.1.3.Phương pháp xác định hoạt độ của β-galactosidase của vi khuẩn
Các bước xác định hoạt độ enzyme ngoại bào và nội bào của vi khuẩn được thực hiện như sau:
• Từ dịch lên men của chủng vi khuẩn sau 24h được đem đi ly tâm (6000 vòng trong 10 phút ở 4ºC) trong môi trường MRS hoặc NA chứa lactose 1%. Tách phần dịch trong sau ly tâm để đem đi xác định hoạt độ ngoại bào.
• Sinh khối còn lại sau ly tâm được pha loãng bằng đệm phosphate pH 6.5. Phá vỡ tế bào bằng sóng siêu âm trong 5 phút với cường độ dao động 70% và tần suất 10 giây on - 15 giây off. Dịch đã phá vỡ tế bào được đem đi ly tâm 6000 vòng trong 10 phút ở 4oC thu phần dịch trong để xác định hoạt độ nội bào.
Hoạt độ của β-galactosidase nội bào và ngoại bào được xác định cho các dịch enzyme tương ứng theo phương pháp của Nguyễn Thu Hà và cs. 2006, được mô tả như sau: Hoạt độ β-galactosidase được xác định bằng cách cho enzyme này phản ứng với cơ chất tổng hợp ortho-nitrophenyl-β -galactopyranoside (oNPG). Dưới tác dụng của β-galactosidase, oNPG sẽ thủy phân thành galactose và o-nitrophenol. O-nitrophenol khi giải phóng sẽ chuyển hỗn hợp phản ứng sang màu vàng và hấp thụ (Abs) ở bước sóng cực đại 420 nm.
Các dung dịch 1 2 3 4 5 6 Vdung dịch gốc (2 mM) (ml) 0 1 2 3 4 5
Vdung dịch đệm (ml) 5 4 3 2 1 0
Nồng độ (mM) 0 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0
- Dùng 0.5ml oNP và 0.75ml Na2CO3 đo ở bước sóng 420nm, dựa vào sự tương quan giữa nồng độ oNP và giá trị Abs ở bước sóng 420nm xác định được tốc độ phản ứng của oNP qua đường chuẩn dựng bằng phần mềm Microsoft Excel.
Hình 3.1. Biểu đồ đường chuẩn oNP
Bước 2: Xác định hoạt độ của enzyme
+ Hút 480 µl oNPG vào ống eppendorf 1,5 ml, sau đó ống eppendorf được cho vào máy ổn nhiệt (thermomixer) ở 30oC, chờ 5 phút để nhiệt độ trong ống eppendorf đạt 30ºC trước khi đưa enzyme vào.
+ Bắt đầu phản ứng bằng cách thêm 20 µl dung dịch enzyme ngoại bào hoặc nội bào sau đó lắc đều ở 600 vòng/phút trong 10 phút.
+ Dừng phản ứng enzyme bằng cách bổ sung 750 µl Na2CO3 0.4 M vào trong ống eppendorf.
+ Đo độ hấp quang trên máy so màu ở bước sóng 420 nm.
Mẫu đối chứng được tiến hành tương tự như mẫu thí nghiệm, trong đó 20 µl dung dịch enzyme được thay thế bằng 20 µl dung dịch đệm phosphate pH 6.5.
Thí nghiệm lặp lại 3 lần, sai số ở 3 thí nghiệm không được vượt quá 5%.
y = 1,403x - 0,0048 R² = 0,9994 -0.2 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 A b s Nồng độ (mM)
Tính kết quả:
Hoạt độ enzyme có trong 1 ml dịch nuôi cấy theo công thức sau:
= − × !
" # " $ × %& '(&./01 . + &*+,-2 × #Độ 567 *ã/9 :ủ7 ./01 .$
Trong đó:
U/ml: Hoạt độ β- galactosidase
Abs420nm: Độ hấp thụ quang của phản ứng màu đo được tại 420 nm Blank: Độ hấp thụ quang của mẫu đối chứng
SlopeoNPstandardcurve: Hệ số góc của đường chuẩn oNP
treaction: Thời gian phản ứng enzyme cơ chất (phút)
1U Lượng enzyme có khả năng xúc tác làm chuyển hóa 1 μmol cơ chất trong một phút ở điều kiện phân tích xác định Số liệu được xử lý dựa vào đường chuẩn và bằng phần mềm Microsoft Excel.
3.4.2. Phương pháp xác định ảnh hưởng của thời gıan nuôi cấy đến sự sinh trưởng và khả năng sinh tổng hợp β-galactosidase trưởng và khả năng sinh tổng hợp β-galactosidase
Để xác định thời điểm nuôi cấy và thu nhận enzyme mà tại đó hoạt độ enzyme của vi khuẩn là cao nhất được tiến hành như sau: các vi khuẩn được tiến hành nuôi lỏng ở nhiệt độ 37 ºC sau 3h lấy mẫu một lần tại các thời điểm 6 giờ, 9 giờ, 12 giờ... đến 30 giờ, để đo mật độ quang tại 600nm và phá vỡ tế bào xác định hoạt độ. Hoạt độ tại các thời điểm được so sánh với nhau để xác định thời điểm sinh enzyme có hoạt độ cao nhất.
3.4.3. Phương pháp tuyển chọn vi khuẩn sinh enzyme có hoạt độ cao ở nhiệt độ thấp độ thấp
Phương pháp tuyển chọn chủng vi khuẩn sinh enzyme có hoạt độ cao ở nhiệt độ thấp được xác định theo phương pháp của Nguyễn Thị Vân Linh và cs., 2013.
Để xác định khả năng chịu lạnh của β-galactosidase, các enzyme được tiến hành xác định hoạt độ ở 30˚C và 4˚C với pH 6,5 (tương đương pH của sữa tươi). Sau đó so sánh phần trăm quan hê ̣ hoa ̣t đô ̣ giữa 30oC và 4oC để xác đi ̣nh khả năng xúc tác của enyme ở 4oC.
3.4.4. Phương pháp tinh sạch sơ bộ β-galactosidase
3.4.4.1. Phương pháp tinh sạch sơ bộ enzyme bằng muối amonisunfate
Dịch enzyme thô sau khi tách còn chứa nhiều tạp chất. Để loại bỏ tạp chất người ta thường sử dụng phương pháp kết tủa phân đoạn bằng muối amonsunfate. Phương pháp tinh sạch được tiến hành theo Wendry Setiyadi Putranto (2007) mô tả như sau:
Tiến hành tinh sạch sơ bộ β-galactosidase bằng cách cho từ từ (NH4)2SO4 tới độ bão hòa 40%, 50%, 60% và 70% vào dịch enzyme thô, khuấy cho tan hết, để cho kết tủa ở 4oC qua đêm. Sau đó ly tâm tách phần tủa ở 10000 vòng/phút, 4oC trong 10 phút. Phần tủa được hòa tan bởi đệm phosphate pH=6.5. Sau đó được xác định hoạt độ enzyme như mô tả ở mục 3.4.1.3 và tiến hành định lượng protein trong enzyme trước và sau tinh sạch bằng phương pháp Bradford (1976).
3.4.4.2. Phương pháp định lượng protein tổng số bằng phương pháp Bradford
Phương pháp xác định protein tổng số theo Bradford, 1976 được mô tả như sau:
Nguyên tắc:
Phương pháp này dựa trên sự thay đổi bước sóng hấp thu cực đại của thuốc nhuộm Coomassie Brilliant Blue khi tạo phức hợp với protein. Trong dung dịch mang tính acid khi chưa kết nối với protein thì thuốc nhuộm ở dạng màu đỏ có bước sóng hấp thu cực đại là 465 nm khi kết hợp với protein thì thuốc nhuộm chuyển sang dạng màu xanh dương và hấp thu cực đại ở bước sóng 595 nm.
Tiến hành:
Bước 1: Dựng đường chuẩn protein
Để xác định protein trong mẫu, đầu tiên ta xây dựng một đường chuẩn với dung dịch protein chuẩn đã biết trước nồng độ. Dung dịch protein chuẩn được sử dụng là bovine serum albumin (BSA). Sau khi cho dung dịch protein vào thuốc nhuộm màu, màu sẽ xuất hiện trong 2 phút và bền tới 1 giờ.
Bảng 3.6. Pha dãy đường chuẩn protein
Ống nghiệm 1 2 3 4 5
BSA ( 1mg/ml)(µl) 80 60 40 20 10
Nước cất (µl) 20 40 60 80 90
Hút từ mỗi ống nghiệm 25µl dịch protein chuẩn vào các ống nghiệm khác có chứa sẵn 1000µl thuốc nhuộm Coomassie Brilliant Blue, lắc đều bằng máy lắc vontex, để yên 20 phút trong bóng tối. Sau 20 phút, tiến hành đo dung dịch bằng máy đo quang phổ kế ở bước sóng 595 nm ta được các giá trị OD, độ hấp thu sẽ tỷ lệ với lượng protein trong mẫu.
Vẽ đường tuyến tính giữa nồng độ protein (mg/ml) với mật độ quang Abs595 ta được phương trình tuyến tính y = ax + b. Dựa vào phương trình để tính được lượng protein có trong mẫu thí nghiệm.
Kết quả: Đường chuẩn có phương trình y = 0.3161x + 0.0387, trong đó x giá trị BSA (mg/ml), y là giá trị OD ở bước sóng 595 nm (hình 3.2).
Hình 3.2. Đường chuẩn protein
Bước 2: Xác định lượng protein tổng số
Các mẫu thí nghiệm được làm tương tự, thay 25µl mẫu protein chuẩn bằng 25µl mẫu thí nghiệm. Lượng protein trong mẫu được tính dựa vào phương trình đường chuẩn protein:
x = <=> ?
Trong đó:
x: là lượng protein trong mẫu (mg) y: là OD595 đo được của mẫu.
y = 0.3161x + 0.0387 R² = 0.9953 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 A bs 5 95 nm BSA (mg/ml) OD tb Linear (OD tb)
3.4.5. Phương pháp xác định đặc tính của enzyme sau khi tinh sạch sơ bộ
3.4.5.1. Phương pháp xác định độ bền ở nhiệt độ thấp của β-galactosidase
Độ bền ở nhiệt độ thấp của β-galactosidase trong pH 6,5 được xác định theo phương pháp của Nguyễn Thị Vân Linh và cs., 2013. Để xác định đô ̣ bền ở nhiê ̣t đô ̣ thấp của enzyme, các enzyme này được ủ ở nhiệt độ 4oC trong pH 6,5. Tại các thời gian ủ khác nhau (1 giờ, 2 giờ, 8 giờ... đến 512 giờ), enzyme được lấy ra để xác định hoạt độ còn lại của enzyme theo phương pháp được mô tả ở mục 3.4.1.3. Độ bền ở nhiệt độ thấp của enzyme được xác định bằng cách so sánh % hoạt độ của enzyme tại thời điểm lấy ra xác định hoạt độ với thời điểm bắt đầu ủ.
3.4.5.2. Phương pháp xác định khả năng phân giải lactose trong sữa tươi của β-galactosidase ở nhiệt độ thấp
Xác định hàm lượng đường lactose phân giải trong sữa tươi nguyên liệu bằng hệ thống HPLC. Bao gồm đầu dò RID và một cột Carbonhydrat C18 (250 x 4 mm, 5 µm; Agilent), với chế độ chạy đẳng dòng sử dụng acetonitrile và nước khử ion (80 v/v) như pha động ở tốc độ dòng chảy 1 ml/phút.
Bước 1: Chuẩn bị chất chuẩn:
Dung dịch chuẩn stock lactose pha từ chuẩn lactose 99,5% xuất xứ từ Đức tại nồng độ 5% pha trong nước khử ion. Các chuẩn làm việc pha từ chuẩn trung gian xuống các nồng độ (0,3125 – 5%). Tất cả các chuẩn được pha mỗi ngày trước khi phân tích.
Bảng 3.7. Số liệu dựng đường chuẩn lactose
Dung dịch 1 2 3 4 5
Nồng độ 5% 2,5% 1,25% 0,625% 0,3125%
Diện tích
Hình 3.3. Biểu đồ đường chuẩn lactose
Bước 2: Chuẩn bị mẫu:
+ Các mẫu thí nghiệm đánh giá khả năng thuỷ phân lactose trong sữa được bố trí bằng hoạt tính enzyme so với lượng lactose như sau: CT1 (1,487 U/1g lactose), CT2 (2,110 U/1 g lactose), CT3 (2,812 U/1g lactose).
+ Mẫu được ủ ở 4oC sau mỗi mốc thời gian 6h, 9h, 12h, 15h, 18h, 21h, 24h, 27h lấy mẫu vào ống eppendorf 2ml đem đun sôi 10 phút để bất hoạt enzyme rồi ly tâm tại 6000 vòng trong 15 phút thu lấy 1ml dịch. Protein trong sữa được kết tủa bằng TCA 10%. Với mỗi 1ml dịch ở trên bổ sung thêm 100µl TCA. Tiếp tục ly tâm ở 6000 vòng trong 15 phút thu dịch. Lọc dịch bằng màng lọc 0,25 µm. Dịch thu được sau lọc cho vào ống Eppendorf sạch chuẩn bị đo hàm lượng lactose trên hệ thống HPLC.
Bước 3 : Chạy HPLC.
Tiêm 20 µL của mỗi mẫu cho phân tích HPLC. Đầu dò RID với một cột Carbonhydrat C18 (250 x 4 mm, 5 µm; Agilent). Các dung môi sử dụng là nước khử ion (dung môi A) và acetonitrile (dung môi B) với tốc độ dòng chảy 1 ml/phút. Rửa giải được chọn chế độ chạy đẳng dòng, hỗn hợp pha động là acetonitrile và nước khử ion (80 v/v).
Bước 4: Xử lý số liệu: Xử lý thống kê bằng Microsoft excel.
3.4.6. Định danh vi khuẩn có khả năng sinh β-galactosidase ưa lạnh
Các vi khuẩn sinh β-galactosidase có hoạt độ cao và bền ở nhiệt độ thấp được đem đi định danh bằng phương pháp sinh học phân tử dựa trên 16 rDNA.
y = 1398792,9574x - 104728,5750 R² = 0,9995 0 1000000 2000000 3000000 4000000 5000000 6000000 7000000 8000000 0 1 2 3 4 5 6 A r e a Nồng độ (%)
- Tách chiết DNA tổng số
DNA tổng số được tách chiết như sau: Sinh khối vi sinh vật được thu lại bằng cách ly tâm sau đó trộn trong 0,5 ml đệm (Tris-HCl, EDTA, NaCl, SDS). Ủ phản ứng ở nhiệt độ phòng trong 10 phút. Bổ sung 0,15 ml CH3COOK. Ly tâm 10000 x g, thu dịch trong, tủa DNA bằng isopropanol tỉ lệ 1:1, tiếp tục ly tâm ở 13000 vòng trong 10 phút ở 40C thu tủa. Rửa tủa bằng etanol 70%. Làm khô tủa, hòa tan lại DNA với 50μl H2O PCR (Đỗ Thị Thu Nga, 2012).
- Khuếch đại gen mã hóa
Sử dụng cặp mồi đặc hiệu đã được sử dụng quốc tế, với trình tự: 27F: 5' AGA GTT TGA TCM TGG CTC AGT 3'
1492R: 5' TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACT T 3'
Thành phần PCR Dung tích Chu trình nhiệt
5 mM dNTPs 1,5µl 1. 95ºC: 5 phút 2. 95ºC: 45giây 3. 55ºC: 1 phút 4. 72ºC: 45 phút, Lặp lại từ bước 2 đến 4: 35 chu kỳ 5. 72ºC: 5 phút 10X Taq Buffer 2,5 µl 5 µM 27F 1 µl 5 µM 1492R 1 µl DNA template 1 µl
Taq DNA pol 0,3 µl
H2O 17,5 µl
Tổng thể tı́ch phản ứng 25 l
- Chạy PCR: Nguyên tắc: Khuếch đại một trình tự lên nhiều lần bằng cặp mồi chuyên biệt. Phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kì nối tiếp nhau.
- Giải trình tự DNA: Sản phẩm PCR được gửi đi giải trình tự tại hãng First-base, Malaysia.
Kết quả giải trình tự 16 rDNA so sánh với thông tin trên ngân hàng gene NCBI để định danh chủng vi khuẩn.
3.4.7. Bước đầu đề xuất quy trình sản xuất sữa tươi tiệt trùng không lactose sử dụng enzyme β-galactose ưa lạnh sử dụng enzyme β-galactose ưa lạnh sử dụng enzyme β-galactose ưa lạnh
Từ các kết quả thu được về enzyme β-galactose ưa lạnh đã tuyển chọn cần tiến hành xem xét khả năng phân giải lactose trong sữa tươi ở nhiệt độ thấp. Từ đó đề xuất ứng dụng cho phù hợp.
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. TUYỂN CHỌN VI KHUẨN SINH β -GALACTOSIDASE
4.1.1. Kết quả xác định vi khuẩn sinh β-galactosidase bằng phương pháp Test X-Gal Test X-Gal
Trong nghiên cứu này, việc xác định vi khuẩn sinh β-galactosidase được thực hiện theo phương pháp mô tả ở mục 3.4.1.1 và 3.4.1.2. Các khuẩn lạc xuất hiện màu xanh indigo là các chủng vi sinh vật có khả năng sinh β-galactosidase (hình 4.1) và kết quả sàng lọc các chủng vi khuẩn sinh β-galactosidase được trình bày ở bảng 4.1.
Bảng 4.1. Khả năng sinh enzyme bằng phương pháp test X-Gal STT Nguồn phân lập Chủng có hoạt tính
1 Mẫu
sữa
1.1 Sữa bò tươi tại trại bò Đông Anh SDA3 1.2 Sữa bò tươi tại trại bò Phù Đổng SPD2.3, SPD3.3
1.3 Sữa chua Vinamilk SC3, SC4, SC5
1.4 Sữa bò trong kho lạnh tại trại bò