Phần 3 Nội dung và phương pháp nghiên cứu
3.4.6.Chẩn đoán virus
3.4. Phương pháp nghiên cứu
3.4.6.Chẩn đoán virus
Thu thập mẫu rầy trên ruộng: Trên 03 ruộng đã chọn sau khi điều tra xác định mật độ rầy lưng trắng và tỷ lệ bệnh LSĐ tiến hành thu mẫu rầy lưng trắng bằng ống hút, rầy thu được được thả vào các hộp nhựa có sẵn lúa, mạ non có cuốn bơng ẩm ở gốc để giữ cho cây lúa ln tươi, rầy thu được đem về phịng thí nghiệm để giám định, xác định tỷ lệ rầy mang virus LSĐ.
- Phương pháp giám định: Giám định bằng phương pháp test que thử nhanh của Trung Quốc, Dot- Blot Elisa
- Chỉ tiêu theo dõi:
+ Tỷ lệ rầy lưng trắng mang virus LSĐ. + Tỷ lệ lúa bị bệnh LSĐ.
3.4.6.1. Giám định bằng phương pháp test que thử nhanh của Trung Quốc * Vật liệu cần
- Chày cối sứ sạch
- Ống eppendorf : 1.5 ml; 0.5 ml
- Đệm nghiền mẫu: đệm phosphate (PBS) với thành phần, nồng độ và PH như trong hướng dẫn.
* Nghiền mẫu
+ Mẫu cây:
- Nghiền mẫu bằng chày cối sứ sạch theo tỷ lên 1:30-50 (w/v) lượng phù hợp : 50mg mô lá/1.5 ml đệm
- Chú ý không cần ni tơ lỏng
nghiền mẫu cùng với đệm sau khi nghiền xong chuyển dịch nghiền vào ống eppendorf 1.5 ml và ly tâm 5 phút đẻ lắng cặn
+Mẫu rầy:
- Cho 1 cá thể rầy vào ống eppendorf 0.5 ml và 150 ml đệm
- Dùng tăm (hoặc dụng cụ phù hợp) để nghiền nát rầy( không dùng rầy đã ngâm cồn)
+ Thử
Nhỏ 3 giọt dịch nghiền (rầy/lá) vào vị trí nhỏ mấu trên que thử
Chờ 10 phút: mẫu dương tính là mẫu có 2 vạch ,mẫu âm tính là mẫu có 1 vạch.
3.4.6.2 Giám định bằng phương pháp dot ELISA của Trung Quốc
(1 Kít đủ cho 200 rầy)
* Thành phần của Kit
+ Kháng thể 1: Kháng thể đơn dòng đặc hiệu SRBSDV (Anti-
SRBSDV monoclonal antibody)
0.06 ml + Kháng thể 2: Kháng thể dê đặc hiệu kháng thể đơn dòng
liên kết HRP (Goat anti-mouse IgG conjugated with HRP)
0.06 ml
+ Dung dịch cơ chất TMB (TMB substrate solution) 10 ml
+ Màng NC (NC membrane) 4 màng
+ Sữa bột tách béo (Dried skimmed milk powder) 1 túi
* Bảo quản (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Kháng thể đơn dòng đặc hiệu SRBSDV và Kháng thể dê đặc hiệu kháng
thể đơn dòng liên kết HRP bảo quản ở - 20 OC. Các thành phần còn lại bảo quản
ở 4 OC.
* Vật liệu người sử dụng tự chuẩn bị
+ Tăm để nghiền rầy: 200 tăm + Đĩa thủy tinh hay đĩa nhựa (dùng để đựng màng, có kích thước phù hợp với màng): 8 đĩa
+ Pipet đơn kênh loại 1 ml kèm theo đầu côn tương ứng: 1 pipet + Pipet đơn kênh loại 10-20 µl kèm theo đầu cơn tương ứng: 1 pipet + Đệm PBS (0.01 M. pH 7.4): 1 L o NaCl (8g/L) o KCl (0.2 g/L) o KH2PO4 (0.2 g/L) o Na2HPO4.12H2O (3 g/L) o Nước cất: lên thể tích đủ 1 L + Đệm PBST: 1 L đệm PBS chứa 0.5 ml Tween-20: 1 L 3.4.6.3. Các bước thực hiện
+ Chuẩn bị dịch nghiền virus. Cho 1 cá thể rầy lưng trắng vào ống ly tâm và
cho 50 µL đệm PBS vào ống. Dùng tăm để nghiền nhuyễn rầy (chú ý thay tăm cho mẫu mới).
+ Cố định virus. Dùng pipet chuyển 2-3 µL dịch nghiền rầy lên màng NC và
để dịch khơ ở nhiệt độ phịng khoảng 10 phút. Chú ý cần phải có đối chứng âm (rầy khỏe) và đối chứng dương (rầy mang virus).
+ Khóa màng. Cho màng vào đĩa chứa 20-30 mL đệm khóa màng. Đệm
khóa màng là đệm PBST chứa 5% (w/v) sữa tách béo. Ủ đĩa ở nhiệt độ phòng
hoặc trong tủ ấm 37 OC trong khoảng 30 – 60 phút để khóa màng (protein của
sữa sẽ liên kết và phủ kín các vị trí trống trên màng).
+ Cố định kháng thể 1. Chuyển màng sang đĩa chứa 30 ml đệm chứa kháng
thể 1. Đệm chứa kháng thể 1 là đệm khóa màng chứa kháng thể 1 được pha theo tỷ lệ 1:3000 (v/v). Cách pha: cho 10 µL kháng thể 1 vào 30 mL đệm
khóa màng. Ủ đĩa ở nhiệt độ phịng hoặc trong tủ ấm 37 OC trong khoảng 45
– 60 phút để kháng thể liên kết virus.
+ Rửa màng 4 lần bằng đệm PBST. Chuyển màng sang đĩa chứa 20-30 ml
đệm PBST. Lắc nhẹ đĩa trên máy lắc khoảng 3 phút. Đổ đệm cũ và thay đệm mới. Lặp lại bước rửa 3 lần.
+ Cố định kháng thể 2. Chuyển màng đã rửa sang đĩa chứa 30 ml đệm chứa
kháng thể 2. Đệm chứa kháng thể 2 là đệm khóa màng chứa kháng thể 2
được pha theo tỷ lệ 1:5000 (v/v). Cách pha: cho 6 µL kháng thể 2 vào 30 mL
đệm khóa màng. Ủ đĩa ở nhiệt độ phịng hoặc trong tủ ấm 37 OC trong khoảng
45 – 60 phút để kháng thể 2 liên kết kháng thể 1.
+ Rửa màng 4 lần bằng đệm PBST và 1 lần bằng đệm PBS. Rửa màng 4
lần bằng đệm PBST. Rửa thêm 1 lần cuối bằng đệm PBS. Thao tác rửa giống như bước 5.
+ Phát hiện phản ứng bằng cố định cư chất TMB. Làm khô mằng bằng
giấy thấm (đặt 1 góc màng trên giấy thấm, khơng đặt giấy thấm trên bề mặt màng). Đặt màng vào 1 đĩa mới. Dùng pipet nhỏ 3 ml dịch cơ chất TMB lên màng. Ủ đĩa ở nhiệt độ phòng trong tối khoảng 20-30 phút. Các chấm có phản ứng dương sẽ xuất hiện màu xanh blue.
(adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});