PHẦN 3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.3.PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.3.1. Xác định mức độ lưu hành và các yếu tố nguy cơ liên quan đến lưu hành một số bệnh trên tôm tại các tỉnh nghiên cứu trong giai đoạn cuối năm hành một số bệnh trên tôm tại các tỉnh nghiên cứu trong giai đoạn cuối năm 2016 đầu năm 2017
Các phương pháp dịch tễ học và thống kê cơ bản, thường quy được sử dụng để thu thập, phân tích và xác định mức độ lưu hành các bệnh; việc so sánh các tỷ lệ lưu hành được dựa trên phân tích thống kê Chi-square (2) – test.
Phương pháp nghiên cứu cắt ngang (cross-sectional study) đã được tiến hành lập lại nhiều lần tại các cơ sở sản xuất, nuôi tôm trên địa bàn 5 tỉnh Ninh Thuận, Bình Thuận, Bến Tre, Sóc Trăng và Bạc Liêu.
Phương pháp lấy mẫu nhiều giai đoạn (multistage sampling) được áp dụng như sau:
Giai đoạn 1:Các tỉnh nghiên cứu, bao gồm Ninh Thuận, Bình Thuận, Bến
Tre, Sóc Trăng và Bạc Liêu được lựa chọn có chủ đích dựa trên các tiêu chí: (1) Là tỉnh trọng điểm về sản xuất tôm giống; (2) Là tình trọng điểm về ni tơm thương phẩm, nhất là ni theo hình thức thâm canh, bán thâm canh; (3) Là tỉnh đã có báo cáo dịch bệnh bệnh trên tơm trong nhiều năm; (4) Địa phương có sự hợp tác tốt trong cơng tác phịng, chống dịch bệnh trong nhiều năm qua.
Giai đoạn 2:Tại mỗi tỉnh, chúng tôi chọn ngẫu nhiên 30 cơ sở hoặc hộ
sản xuất, nuôi tôm (sau đây gọi chung là cơ sở ni tơm) theo hình thức bán thâm canh và thâm canh tại các vùng nuôi tôm trọng điểm, cụ thể:
Số lượng cơ sở tại mỗi tỉnh cần giám sát được tính theo cơng thức:
2 2 1 1 e z n
Trong đó: P: Là giá trị lưu hành ước tính ở cấp độ cơ sở là 10%; e: Là sai số tuyệt đối (giữa giá trị ước tính và giá trị thực) là 10%; z: Chỉ số thể hiện
khoảng tin cậy 95% (z = 1,96).
Trường hợp tỉnh chỉ có 01 vùng ni tơm trọng điểm thì chọn ngẫu nhiên 30 cơ sở ni tơm của vùng đó để lấy mẫu.
Trường hợp tỉnh chỉ có 02 vùng ni tơm trọng điểm thì chọn ngẫu nhiên 15 cơ sở nuôi tôm/vùng để lấy mẫu.
Trường hợp tỉnh trên 03 vùng ni tơm trọng điểm thì chọn ngẫu nhiên ít nhất 10 cơ sở ni tơm/vùng để lấy mẫu.
Các tỉnh lập danh sách các cơ sở sản xuất, ni tơm trong bảng Excel, sau đó chọn ngẫu nhiên và ký hiệu mã số (từ 01 – 30) các cơ sở để lấy mẫu.
Do trong quá trình giám sát, có cơ sở khơng tiếp tục ni hoặc khơng tiếp tục tham gia nên chọn các cơ sở khác thay thế trên các vùng ni đó. Cụ thể số cơ sở tại các tỉnh như sau:
Tỉnh Ninh Thuận: 30 cơ sở tại 02 huyện Ninh Hải, Ninh Phước. Tỉnh Bình Thuận: 30 cơ sở tại huyện Tuy Phong.
Tỉnh Bến Tre: 46 cơ sở tại 03 huyện Bình Đại, Thạnh Phú, Ba Tri. Tỉnh Sóc Trăng: 32 cơ sở tại 03 huyện Vĩnh Châu, Mỹ Xuyên, Trần Đề. Tỉnh Bạc Liêu: 46 cơ sở tại 03 huyện Tp Bạc Liêu, Đơng Hải, Hịa Bình.
Giai đoạn 3:Mỗi cơ sở giám sát lựa chọn ngẫu nhiên 02 ao ni tơm để
lấy mẫu; các ao này có thể khác nhau ở mỗi lần lấy mẫu, nhưng phải bảo đảm các ao thuộc các cơ sở đã được lựa chọn. Trong trường hợp cơ sở chỉ có 01 ao thì chọn thêm 01 ao của hộ liền kề để lấy mẫu. Mẫu bao gồm mẫu tôm và môi trường.
Giám sát bị động: Các cở sở sản xuất giống, nuôi tôm lập sổ theo dõi hàng ngày về tình hình sản xuất và dịch bệnh.Hướng dẫn chủ cơ sở nuôi tôm báo cáo cho Trạm Thú y và lấy mẫu gửi về phòng xét nghiệm của Cơ quan Thú y vùng VI (đối với tỉnh Ninh Thuận, Bình Thuận và Bến Tre) và Cơ quan Thú y vùng VII (đối với tỉnh Sóc Trăng, Bạc Liêu) khi có nghi ngờ xuất hiện bệnh.
Giám sát chủ động:
* Cách lấy mẫu và bảo quản mẫu:
Đối với mẫu tôm tại cơ sở sản xuất tơm giống: Lấy mẫu tơm post ở 5 vị trí khác nhau trong cùng một ao ương nuôi.
Đối với mẫu tôm tại cơ sở nuôi tôm thương phẩm:
Trường hợp cơ sở ni tơm chỉ có 01 ao ni thì lấy mẫu tại 5 vị trí khác nhau của ao nuôi.
nhất 02 ao nuôi; tại mỗi ao ni lấy mẫu ở các vị trí khác nhau để đảm bảo tổng số lấy 25 con tôm/cơ sở nuôi.
Mẫu nước, bùn trong ao nuôi: Lấy 05 mẫu nước và 05 mẫu bùn ở tầng đáy tại 05 vị trí khác nhau trong ao (mỗi vị trí lấy 100 ml). Sau đó, 05 mẫu nước được trộn thành 01 mẫu và 05 mẫu bùn được trộn thành 01 mẫu.
Mẫu thức ăn tươi sống: Tại các cơ sở sản xuất tôm giống lấy 02 mẫu thức ăn tươi sống.
Bảng tổng hợp số lượng mẫu cần lấy chi tiết tại Phụ lục 2.
Tất cả các loại mẫu cần được bảo quản lạnh để vận chuyển về phịng thí nghiệm của Cơ quan Thú y vùng VI (đối với tỉnh Ninh Thuận,Bình Thuận và Bến Tre) và Cơ quan Thú y vùng VII (đối với tỉnh Sóc Trăng và Bạc Liêu) để xét nghiệm kèm theo biên bản lấy mẫu như Phụ lục 5. Tại phịng thí nghiệm mẫu được bảo quản ở nhiệt độ từ 4-8oC, xét nghiệm phát hiện tác nhân gây bệnh đốm trắng, bệnh hoại tử gan tụy cấp, bệnh hoại tử cơ quan tạo máu và biểu mô bằng phương pháp Real-time PCR.Biên bản bàn giao mẫu xét nghiệm như Phụ lục 7. Mẫu được đặt mã theo hướng dẫn tại Phụ lục 3.
* Thời điểm lấy mẫu:Trước lúc thả nuôi 02 tuần và sau khi thu hoạch 02
tuần, liên tục trong 05 tháng, bắt đầu từ tháng 8/2016.Sau khi thu hoạch chỉ lấy mẫu bùn, mẫu nước, mẫu giáp xác ở ao nuôi.
* Tần suất lấy mẫu:Lấy mẫu với tần suất: 02 lần/tháng; các lần cách
nhau 02 tuần; lần 1 lấy vào tuần đầu của tháng; lần 2 lấy vào tuần thứ 3 của tháng. Trong suốt quá trình giám sát (05 tháng), khơng nhất thiết lấy mẫu lặp lại ở cùng một ao, có thể lấy mẫu ở nhiều ao khác nhau, nhưng các ao này đều phải thuộc cơ sở nuôi tôm đã được lựa chọn và gán mã số (từ 01 – 30).
* Số lượng mẫu tại mỗi cơ sở:
Mẫu tôm tại cơ sở sản xuất tôm giống: Lấy 1,5 gram tôm post (gồm 03 gram/vị trí của 5 vị trí khác nhau trong cùng một ao ương nuôi); và lấy tối thiểu 05 con tơm bố mẹ loại thải (nếu có).
Mẫu tôm tại cơ sở nuôi tôm thương phẩm: Lấy 25 con tơm ở 5 vị trí khác nhau của mỗi cơ sở nuôi.
*Lấy mẫu, bảo quản và vận chuyển mẫu giám sát:Thực hiện theo
QCVN 01-83:2011/BNNPTNT (ban hành kèm theo Thông tư số 71/2011/TT- BNNPTNT ngày 25/10/2011 của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn) và theo hướng dẫn tại Phụ lục 6.
* Chỉ tiêu xét nghiệm:Tại phịng thí nghiệm được Bộ Nơng nghiệp và
Phát triển nông thôn chỉ định (Cơ quan Thú y vùng VI và Cơ quan Thú y vùng VII), cụ thể: Bệnh đốm trắng do White spot sydrome virusbằng phương pháp Real-time PCR; Bệnh hoại tử gan tụy cấp tính do Vibrio parahaemolyticusbằng phương pháp PCR; Bệnh hoại tử cơ quan tạo máu và
biểu mô do Infectious Hypodermal and Hematopoietic necrosis virusbằng
phương pháp Real-time PCR.
* Thu thập thông tin về các yếu tố nguy cơ tại cơ sở sản xuất, nuôi tôm thương phẩm:Thu thập thông tin theo biểu mẫu thiết kế. Mỗi lần lấy mẫu
đều phải thu thập (điều tra) thông tin theo phiếu điều tra (Phụ lục 8) kể cả trong trường hợp thông tin giống nhau giữa các lần lấy mẫu.Một số hình ảnh trong quá trình thực hiện đề tài ở Phụ lục 1.
* Quản lý và phân tích số liệu
Thông tin và dữ liệu từ thực địa được nhập vào file MS. Excel.
Phân tích mơ tả tình hình nuôi tôm, dịch tễ học mô tả (theo không gian, thời gian và theo đối tượng) theo các phương pháp dịch tễ, thống kê thường quy.
Tỷ lệ các cơ sở ni tơm bị bệnh được tính theo phương pháp của Fleiss (Fleiss et al., 2013). So sánh tỷ lệ các cơ sở bị bệnh được phân tích, dựa vào chỉ số Chi-square.
Phân tích đa tầng nhiều biến (multilevel analysis) được áp dụng để định lượng các yếu tố nguy cơ theo các phân tầng khác nhau (Dohoo et al., 2003), cụ thể theo các bước sau:
Bước 1: Xác định “Đầu ra” là cơ sở có tơm bị đốm trắng hay hoại tử gan
tụy cấp tính hay hoại tử cơ quan tạo máu và biểu mô.
Bước 2: Phân tích sàng lọc (bivarriate analyses) để xác định mối liên hệ
giữa “Đầu ra” và từng yếu tố nguy cơ. Phương pháp kiểm tra của Wald (A. Agresti, 2007) được sử dụng để xác định mối liên hệ giữa các biến nguy cơ với “Đầu ra”. Tất cả các biến nguy cơ có mối liên hệ với “Đầu ra” về mặt thống kê,
sinh học và có giá trị P < 0.2 được giữ lại để đưa vào phân tích đa biến (Bước 3). Những biến nguy cơ có mối liên hệ với với “Đầu ra” ở giá trị P > 0.2 thì được loại bỏ, theo nguyên tắc, loại bỏ các biến có giá trị P cao nhất cho đến khi chỉ cịn các biến có P < 0.2.
Bước 3: Phân tích đa biến (multivariable analyses): Tất cả các biến có P <
0.2 được xác định tại Bước 2 được đưa vào mơ hình đa biến và chạy mơ hình phân tích. Chỉ những biến nguy cơ nào có mối liên hệ về mặt thống kê, sinh học với “Đầu ra” và có giá trị P < 0.05 thì giữ lại để tính ảnh hưởng của các biến đa cấp tại Bước 4. Yếu tố ảnh hưởng ngẫu nhiên cũng được đưa vào mơ hình hồi quy logic hỗn hợp (mixed-effects logistic regression model) để phân tích và đánh giá mức độ ảnh hưởng không thể đo được của các yếu tố ở cấp cơ sở nuôi tôm, cấp xã và cấp tỉnh lên khả năng một cơ sở nuôi tôm bị đốm trắng, hoại tử gan tụy cấp tính, hoại tử cơ quan tạo máu và biểu mơ. Dựa trên cách tiếp cận này, chuyển dạng logic (logit transform) cơ sở bị bệnh i ở xã j tại tỉnh k, pijk, được mơ hình
hóa theo chức năng tuyến tính của một loạt các yếu tố ảnh hưởng m là β1… βm và ảnh hưởng của các yếu tố nguy cơ ở các cấp độ cơ sở nuôi ni, cấp xã Xj và tỉnh
Pk được tính theo cơng thức sau (Bước 4):
ijk k j mijk m i m ijk ijk P X x p p 1 0 1 log
Kết quả của mơ hình cuối cùng được thể hiện bởi tỷ số chênh đã được điều chỉnh cho mỗi biến nguy cơ. Tỷ số chênh (odds ratio, OR) lớn hơn 1 cho thấy cơ sở nuôi tôm khi phơi nhiễm với yếu tố nguy cơ có khả năng bị bệnh tăng lên. Ngược lại, nếu OR < 1 cho thấy nguy cơ sở nuôi tôm bị bệnh giảm đi. OR = 1 cho thấy khơng có ảnh hưởng của các yếu tố lên nguy cơ các cơ sở nuôi bị bệnh.
Đường cong đặc trưng thể hiện hoạt động của bộ thu nhận (Receiver Operating Characteristic, ROC) được vẽ để biểu thị khả năng dự đốn của mơ hình logic. Vùng dưới đường cong ROC có giá trị dao động từ 0-1 để mô tả khả năng dự đốn của mơ hình đối với một cơ sở bị bệnh hoặc không bị bệnh. Giá trị dưới đường cong ROC càng lớn, cho thấy khả năng mơ hình phỏng đốn chính xác càng cao (Hosmer and Lemeshow, 2000). Phân tích thống kê được tiến hành bằng cách sử dụng bộ phân tích thống kê lme4 (Bates and Sarkar, 2007) ở chương trình R 2.15.2 (R Development Core Team, 2012).