3.5.1. Phương pháp nghiên cứu dịch tễ
Sau khi ghi nhận có triệu chứng bệnh, tiến hành thu thập, thống kê tỷ lệ mắc bệnh, tỷ lệ chết. Xác định thời điểm xuất hiện bệnh, vật mang và con đường truyền lây của bệnh.
3.5.2. Phương pháp chẩn đoán lâm sàng
Sau khi thu thập mẫu, quan sát triệu chứng lâm sàng, quay phim, chụp ảnh, ghi chép số liệu từng cá thể và toàn đàn.
3.5.3. Phương pháp mổ khám
Gà mắc bệnh ORT được cố định trên bàn mổ hoặc khay mổ, mổ khám theo trình tự từ trên xuống dưới, bộc lộ các khí quan để quan sát, tìm ra những biến đổi bệnh tích đại thể.
3.5.4. Phương pháp lấy mẫu và bảo quản mẫu làm tiêu bản
Các mẫu được lấy theo quy định của ngành.
Mẫu cơ quan tổ chức cần lấy đúng (lấy đúng cơ quan, đúng vùng tổn thương điển hình), lấy đủ (đủ thành phần cấu tạo cần nghiên cứu và đủ lượng cần thiết).
Mẫu có thể là dịch hầu họng và dịch khí quản và dịch phế quản, phổi của gà mắc bệnh ở mọi lứa tuổi. Ta có thể lấy mẫu theo phương pháp sau:
- Đối với dịch ngoáy mũi và dịch ngoáy hầu họng dùng tăm bông vô trùng ngoái sâu vào lỗ mũi/ hầu họng của gà bệnh đã được lau sạch bằng cồn 70° để một thời gian cho dịch mũi thấm vào tăm bông → Để tăm bông vào ống nghiệm chứa môi trường vận chuyển (Stuart TranspORT Medium), môi trường nước thịt vô trùng hoặc dung dịch PBS, đậy nút và ghi nhãn rồi đưa về phòng thí nghiệm sau 2-8h. Nếu ở xa phòng thí nghiệm thì môi trường vận chuyển phải để ở tủ lạnh.
- Đối với dịch khí quản hay dịch phế quản: dùng kéo vô trùng cắt dọc khí quản hay phế quản, sau đó dùng tăm bông vô trùng đưa dọc theo dường ống để lấy dịch. Đặt tăm bông vào trong môi trường như trên, đậy nút ghi nhãn và vận chuyển về phòng thí nghiệm.
- Với mẫu là tổ chức phổi: sau khi mổ khám gà, dùng kéo vô trùng cắt lấy tổ chức phổi ở vùng định xét nghiệm.
3.5.5. Phương pháp PCR
PCR được sử dụng để phát hiện các ORT trong mẫu dịch khí quản được lấy từ các gà mắc bệnh nặng. Thành phần của PCR là: đoạn DNA đích, các mồi có trình tự bổ sung với DNA đích, hỗn hợp của 4 loại base và một DNA-polymerase phù hợp.
Chuẩn bị mẫu cho phản ứng PCR
Lấy bệnh phẩm được bảo quản ở tủ -80ºC cho tan đá.
Nghiền bệnh phẩm cắt nhỏ bệnh phẩm cho vào Eppendorf 1,5ml nghiền nát bệnh phẩm với môi trường DMEM thành huyễn dịch đồng nhất. Sau đó đem ly tâm bỏ phần cặn. Phần dung dịch thu được bảo quản ở -80oC cho đến khi sử dụng.
Lưu ý: Tất cả các thao tác được tiến hành trong buồng cấy vô trùng các hóa chất được sử dụng đều vô trùng, các dụng cụ được sử dụng đều phải được hấp vô trùng trước và sau khi sử dụng.
Tách chiết DNA bằng Kít QIA gen
Sử dụng bộ kit QIAamp DNA Mini Kit của Hãng QIAGEN (QIAGEN Inc., USA) để tách chiết DNA tổng số theo các bước:
Bước 1: Cho 20µl Proteinase K vào ống Eppendorf. Thêm 180 µl
Buffer ATL, trộn đều ủ ở 56oC trong 3 giờ.
Bước 2: Thêm 4µl ARNase và 200 µl Buffer AL. Ủ ở 70oC trong 30 phút.
Bước 3: Thêm 200 µl Ethanol (96 - 100%), trộn đều.
Bước 4: Chuyển mẫu sang cột có màng lọc, ly tâm 13000 vòng/phút
trong 1 phút. Loại bỏ dịch ở dưới.
Bước 5: Thêm 500µl Buffer AW1, rồi ly tâm 8000 vòng/phút trong 1
phút, bỏ dịch dưới.
Bước 6: Thêm 500µl Buffer AW2, ly tâm 13000 vòng/phút trong 2
phút, bỏ dịch dưới. Tiếp tục ly tâm thêm 1 lần nữa như trên.
Bước 7: Chuyển cột lọc đã giữ lại ADN hệ gen của vi khuẩn trong
màng lọc sang ống Eppendorf loại 1,5ml. Thêm 100 µl Buffer AE, để ở nhiệt độ phòng trong 5 phút. Sau đó ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút, thu dịch lỏng bên dưới, bảo quản ở -20oC.
Cách tiến hành chạy PCR
Mẫu DNA sau khi tách chiết sẽ được hỗn hợp với các thành phần được trình bày ở bảng sau:
Thành phần phản ứng Thể tích cần lấy (μl)
Master mix 2X 12.5
Mẫu DNA chiết tách 5
Primer Forwad 0.5
Primer Reverse 0.5
Nuclease-Free water 6.5
Tổng thể tích 25
Sử dụng cặp mồi đặc hiệu để khuếch đại đoạn gen rnn: OR16S - F1: GAG AAT TAA TTT ACG GAT TAA G; OR16S - R1: TTC GCT TGG TCT CCG AAG AT (Van and Hafez, 1999).
Tên mồi Trình tự nucleotide 5’-3’ Kích thước
Mồi xuôi AGAATTAATTTACGGATTAAG
784bp
Tiến hành phản ứng khuếch đại sản phẩm trong máy PCR theo chu kỳ nhiệt sau:
Giai đoạn Bước tổng hợp Nhiệt độ (0C) Thời gian Chu kỳ
1 Duỗi mạch 94 5phút 1
2
Duỗi mạch 94 30 giây
45
Gắn mồi 52 60 giây
Tổng hợp sợi mới 72 90 giây
3 Hoàn chỉnh 72 7 phút 1
4 Giữ sản phẩm 4 ∞
Cách tiến hành điện di trên gel agarose đọc kết quả
Bước 1: Chuẩn bị dung dịch đệm và bản gel
- Bản gel được chuẩn bị bằng dung dịch đệm TBE 1X hòa tan với 1,2 gram agarose đặt trong lò vi sóng ở 1000C trong 5 phút, để nguội 45-500C bổ sung 03µl Ethidium bromide (nồng độ 10µg/10µl). Sau đó đổ vào khuôn có các lược được cài sẵn để tạo bản gel. Khi bản gel đã đông cứng, đặt bản gel vào bể điện di và đổ đung dịch đệm TBE ngập bản gel.
Bước 2: Tra mẫu điện di
Thêm 2 µl loading dye vào 8 µl sản phẩm PCR, trộn đều hỗn dịch bằng pipet và chuyển vào các giếng trong bản thạch. Điện di đồng thời cả thang chuẩn DNA thường sử dụng từ 4-6 µl DNA marker.
Bước 3: Chạy điện di
Nguồn điện trong điện di sử dụng ở hiệu điện thế 100V cường độ 100mA, thời gian chạy điện di trong 30 phút.
Bước 4: Đọc kết quả
Sau khi điện di, vị trí các đoạn DNA được phát hiện bằng máy phát tia UV. Sau đó chụp ảnh và lưu kết quả. Sản phẩm PCR có độ dài 784 bp được điện di trên gel 1,2% trong môi trường TBE 1X.
- Mẫu dương tính với vi rút khi giếng chứa mẫu điện di xuất hiện vạch DNA tương ứng với độ dài đoạn gen nhân lên bp.
- Mẫu âm tính khi không xuất hiện vạch DNA tương ứng với độ dài đoạn gen khuếch đại.
3.5.6. Phương pháp nuôi cấy và phân lập vi khuẩn
Phân lập vi khuẩn là việc tách riêng vi khuẩn từ quần thể ban đầu nhằm mục đích đưa vi khuẩn về dạng thuần khiết. Vi sinh vật ở dạng thuần khiết là giống vi sinh vật được tạo ra từ một tế bào ban đầu. Đây là một khâu có ý nghĩa rất quan trọng trong việc nghiên cứu và ứng dụng vi sinh vật.
Vi khuẩn sinh trưởng trong điều kiện hiếu khí, hiếu khí tùy tiện hay yếm khí tùy tiện. Điều kiện sinh trưởng tối ưu là ở 37°C, tuy nhiên vẫn sinh trưởng được ở 30 - 42°C. Vi khuẩn này sinh trưởng mạnh khi bổ sung thêm 5 - 10% máu cừu vào môi trường nuôi cấy nhưng cũng sinh trưởng được trên môi trường tryptose soy agar và chocolate agar.
3.5.7. Phương pháp thử các đặc tính sinh hóa
+ Phản ứng thử Oxidase: Phát hiện khả năng sinh enzyme cytochrom oxidase của vi khuẩn.
- Kỹ thuật: Dùng đũa thủy tinh lấy 1 khuẩn lạc miết trên miếng giấy đã tẩm sẵn hóa chất phản ứng và được thêm 1 giọt nước muối sinh lý. Quan sát kết quả trong vòng 10s đầu. Phản ứng (+) cho kết quả màu xanh tím.
+ Phản ứng Catalase: phát hiện enzym catalase gây xúc tác phản ứng: H2O2 → O2 + H2O.
- Kỹ thuật: Chọn khuẩn lạc nghi ngờ lên trên mặt 1 lam kính sạch. Sau đó nhỏ H2O2 3% và quan sát sau 1 - 2s.
Nếu có bọt khí xuất hiện --> phản ứng (+)
Nếu khôngcó bọt khí xuất hiện --> phản ứng (-)
+ Phản ứng Kova’s (Indol test): Vi khuẩn có enzyme tryptophanase có khả năng thủy phân acid amin tryptophan sinh indol, acid pyruvic và NH3+. Indol sinh ra sẽ kết hợp với nhóm (CHO) của p – dimetthylaminobenzaldehyd có trong thuốc thử Kovac’s hình thành nên phức hợp màu đỏ.
Kỹ thuật: Vi khuẩn được cấy vào trong môi trường Tryptophan, để ở 35 – 370C trong 18 - 24h. Nhỏ 3 – 5 giọt thuốc thử Kovac vào trong ống nghiệm. Quan sát kết quả. Phản ứng (+) sẽ xuất hiện vòng màu đỏ phía trên dung dịch nuôi cấy.
3.5.8. Phương pháp kháng sinh đồ
Xác định tính mẫn cảm với các loại kháng sinh của các chủng vi khuẩn phân lập được từ đường hô hấp của gà bằng phương pháp kháng sinh đồ. Sử dụng môi trường tăng sinh Mueller Hinton Agar làm kháng sinh đồ.
Tiến hành:
Ghi thông tin lên nắp đĩa thạch, đánh dấu vị trí đặt kháng sinh lên phần đĩa chứa thạch bằng các số từ 1 đến 7. Mỗi đĩa thạch tương ứng với 7 kháng sinh.
Sử dụng pipet 100, lấy 0,1 ml canh khuẩn cần kiểm tra nhỏ vào đĩa thạch và láng cho đều, đến khi bề mặt đĩa thạch khô. Sau đó lần lượt dùng phanh kẹp giấy đã tẩm các loại kháng sinh đặt vào vị trí đã đánh dấu, ấn nhẹ cho dính chặt vào mặt thạch. Sau đó đặt đĩa thạch vào trong tủ ấm 37ºC, 5% CO2
trong vòng 48h.
Đọc kết quả sau 48h, đo đường kính vòng tròn vô khuẩn, căn cứ vào tiêu chuẩn của từng loại kháng sinh để xác định tính mẫn cảm với kháng sinh của vi khuẩn, so sánh kích thước vòng vô khuẩn với Bảng 3.2, sau đó ghi lại kết quả: H (High): mẫn cảm cao, I (Intermediate): mẫn cảm trung bình, R (Resitant): kháng.
Căn cứ vào tiêu chuẩn của từng loại kháng sinh để xác định tính mẫn cảm của vi khuẩn: Vi khuẩn rất mẫn cảm với kháng sinh được đánh giá: +++, Vi khuẩn mẫn cảm với kháng sinh: ++, Vi khuẩn ít mẫn cảm với kháng sinh: +.
Bảng 3.1. Tiêu chuẩn của nhà cung cấp giấy tẩm kháng sinh
Tên thuốc Ký hiệu kháng sinh Hàm lượng kháng sinh (µg)
Đường kính vòng vô khuẩn (mm)
R I H 1. Amoxcicilin/ Clavulanic acid AMC 20/10 <13 14 – 17 >18 2. Ampicilline AMP 10 <11 12 – 13 >14 3. Tetracycline TE 30 <14 15 – 18 >19 4. Lincomycin L 15 <15 15 – 17 >17 5. Sulfamethoxazol – Trimethoprin SXT 23,75/1,25 <10 11 – 15 >16 6. Doxycilin DO 30 <13 14 – 16 >17 7. Erythromycin E 15 <13 14 – 22 >23 Nguồn: Ocoid từ NCCLS (1990) M2A4 (1982)
3.5.9. Phương pháp phân tích và xử lý số liệu
Các kết quả thu được trong các thí nghiệm được xử lý theo phương pháp thống kê sinh học và phần mềm Excel, phần mềm Minitab 16.
3.6. NGUYÊN LIỆU NGHIÊN CỨU 3.6.1. Mẫu bệnh phẩm 3.6.1. Mẫu bệnh phẩm
- Gà và các mẫu bệnh phẩm nghi mắc bệnh ORT thu thập được như: phổi, khí quản, phế quản, mẫu Swab (dịch ngoáy miệng, ổ khí quản),…. Lấy ở các trang trại chăn nuôi gà ở các huyện trên tỉnh Bắc Ninh.
3.6.2. Máy móc
- Tủ ấm, tủ -80 oC, kính hiển vi, máy ly tâm, máy votex, máy PCR, máy chạy điện di, máy chụp gel, máy hấp ướt, tủ sấy khô, tủ lạnh bảo quản mẫu, tủ lạnh bảo quản môi trường…
3.6.3. Dụng cụ
Dao, kéo, panh kẹp, khay, đèn cồn, eppendorf, lanmen, lam kính, bộ dụng cụ nhuộm, ống nghiệm, đĩa lồng, pipet, dụng cụ bảo hộ….
3.6.4. Hóa chất
- Hoá chất nhuộm Gram: tím Genxian, đỏ fucxin, cồn axetol 70 độ, dung dịch lugon.
- Thử phản ứng oxydase: giấy thử phản ứng oxydase tẩm 1% dung dịch Tetrametyl-p. Phenylenediamine hydrochloride.
- Thử phản ứng catalase: H2O2 3%.
- Thử phản ứng indol: thuốc thử Kovac’s, nước trypton.
- Kit QIAamp DNA Mini Kit của hãng QIAGEN để chiết tách DNA. - Thử phản ứng kháng sinh đồ: các loại kháng sinh.
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. ĐÁNH GIÁ TÌNH HÌNH CHĂN NUÔI GIA CẦM CỦA CÁC HUYỆN TẠI TỈNH BẮC NINH QUA CÁC NĂM TẠI TỈNH BẮC NINH QUA CÁC NĂM
Bắc Ninh là tỉnh có diện tích nhỏ nhất Việt Nam, thuộc vùng đồng bằng Sông Hồng. nằm trong tam giác kinh tế trọng điểm Hà Nội - Hải Phòng - Quảng Ninh và là cửa ngõ phía Đông Bắc của thủ đô Hà Nội. Tỉnh có địa giới hành chính tiếp giáp với các tỉnh: Bắc Giang ở phía Bắc, Hải Dương ở phía Đông Nam, Hưng Yên ở phía Nam và thủ đô Hà Nội ở phía Tây. Đây là lợi thế để Bắc Ninh lưu thông sản phẩm để phát triển nông nghiệp. Năm 2015, tỉnh Bắc Ninh có diện tích tự nhiên 82,271.2 km2, dân số 1. 038.299 người. Về mặt hành chính, tỉnh có 8 đơn vị hành chính cấp huyện, gồm: 1 thành phố, 1 thị xã và 6 huyện; 126 đơn vị hành chính cấp xã, gồm: 17 phường, 6 thị trấn, 102 xã. Bắc Ninh là tỉnh đầu tư phát triển công nghệ cao nên diện tích nông nghiệp ngày càng giảm. Nắm bắt được tình hình đó, Bắc Ninh phát triển chăn nuôi trang trại ngoài khu dân cư theo hướng an toàn sinh học, tập trung thành từng vùng, ứng dụng công nghệ cao vào chăn nuôi.
Trong những năm qua. tình hình dịch bệnh diễn ra ngày càng phức tạp và khó kiểm soát. Công tác phòng, chống dịch được triển khai thực hiện nghiêm ngặt, tiến hành tiêu hủy con bệnh để tránh lây lan ra nhiều vùng nên sản xuất chăn nuôi của tỉnh có sự chững lại về số lượng đàn. Tình hình phát triển chăn nuôi gia cầm của các huyện trong quý I + II trên địa bàn tỉnh Bắc Ninh qua các năm được thể hiện trong bảng 4.1.
Kết quả bảng 4.1, đánh giá tình hình chăn nuôi gia cầm của cả tỉnh Bắc Ninh ít biến động qua các năm. Năm 2014, trong 6 tháng đầu năm, toàn tỉnh đạt khoảng 4,6 triệu con nhưng so với cùng kỳ, năm 2015, 2016 lần lượt khoảng 4,2 và 4,5 triệu con. Chăn nuôi gia cầm ở thành phố Bắc Ninh, huyện Gia Bình, Lương Tài, Thuận Thành, Tiên Du, Từ Sơn là những huyện, thành phố nhìn chung có số lượng đàn gia cầm phát triển ổn định trong quý I + II qua các năm. Số lượng đàn gia cầm giảm qua các năm trong 6 tháng đầu năm ở các huyện như: Quế Võ, Yên Phong. Số lượng đàn gia cầm thấp nhất trong toàn tỉnh là ở thành phố Bắc Ninh (6 tháng đầu năm 2016 chỉ đạt 213 nghìn con, bằng 1/2 hoặc 1/3 so với các huyện khác trong tỉnh).
Bảng 4.1. Tình hình phát triển gia cầm của các huyện quí I + II trên địa bàn tỉnh Bắc Ninh qua các năm
Huyện/ Thành phố Tổng số (nghìn con)
Năm 2014 Năm 2015 Năm 2016 Thành Phố Bắc Ninh 206 208 213 Gia Bình 753 524 634 Lương Tài 453 480 528 Quế Võ 683 518 538 Thuận Thành 574 560 582 Tiên Du 639 598 634 Từ Sơn 484 487 525 Yên Phong 900 868 879 Tổng 4692 4243 4533
Nguồn: theo cục Thống kê Bắc Ninh
Điều này có thể giải thích như sau: Trong năm 2015, năm 2016 do ảnh hưởng của thời tiết và tình trạng buôn bán, giết mổ gia súc, gia cầm chưa được kiểm soát chặt chẽ nên tình hình dịch bệnh vào những tháng đầu năm, cuối năm đã xảy ra dịch bệnh, đặc biệt là bệnh cúm gia cầm. Trong đó, Tiên Du là huyện được đầu tư chăn nuôi theo hướng trang trại, chăn nuôi công nghiệp nên tình hình dịch bệnh được kiểm soát mạnh, công tác phòng bệnh và vệ sinh. Chính vì vậy, so với cùng kì, ở huyện Tiên Du số lượng đàn vẫn đang đà phát phát triển.
Tỉnh Bắc Ninh là một tỉnh có diện tích nhỏ nhất trên cả nước. Diện tích đất nông nghiệp càng ngày càng giảm. Chính vì vậy, Đảng và Chính Quyền Bắc Ninh đang đưa ra nhiều chủ trương và định hướng phát triển chăn nuôi đúng, các chính sách hỗ trợ ban hành kịp thời nhằm đưa tình hình chăn nuôi ở Bắc Ninh sẽ phát triển theo hướng sản phẩm nông nghiệp hàng hóa trong thời gian tới.
4.2. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM DỊCH TỄ CỦA BỆNH ORT TRÊN ĐÀN GÀ LƯƠNG PHƯỢNG TRÊN ĐÀN GÀ LƯƠNG PHƯỢNG
4.2.1. Tình hình gà mắc bệnh ORT theo lứa tuổi
Trong quá trình nghiên cứu, chúng tôi tiến hành điều tra, thu thập số liệu, tiến hành mổ khám gà chết, kiểm tra bệnh tích và ghi chép lại từ đó đánh giá khả