PHẦN 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.5. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.5.5. Phương pháp PCR
PCR được sử dụng để phát hiện các ORT trong mẫu dịch khí quản được lấy từ các gà mắc bệnh nặng. Thành phần của PCR là: đoạn DNA đích, các mồi có trình tự bổ sung với DNA đích, hỗn hợp của 4 loại base và một DNA-polymerase phù hợp.
Chuẩn bị mẫu cho phản ứng PCR
Lấy bệnh phẩm được bảo quản ở tủ -80ºC cho tan đá.
Nghiền bệnh phẩm cắt nhỏ bệnh phẩm cho vào Eppendorf 1,5ml nghiền nát bệnh phẩm với môi trường DMEM thành huyễn dịch đồng nhất. Sau đó đem ly tâm bỏ phần cặn. Phần dung dịch thu được bảo quản ở -80oC cho đến khi sử dụng.
Lưu ý: Tất cả các thao tác được tiến hành trong buồng cấy vơ trùng các hóa chất được sử dụng đều vô trùng, các dụng cụ được sử dụng đều phải được hấp vô trùng trước và sau khi sử dụng.
Tách chiết DNA bằng Kít QIA gen
Sử dụng bộ kit QIAamp DNA Mini Kit của Hãng QIAGEN (QIAGEN Inc., USA) để tách chiết DNA tổng số theo các bước:
Bước 1: Cho 20µl Proteinase K vào ống Eppendorf. Thêm 180 µl
Buffer ATL, trộn đều ủ ở 56oC trong 3 giờ.
Bước 2: Thêm 4µl ARNase và 200 µl Buffer AL. Ủ ở 70oC trong 30 phút.
Bước 3: Thêm 200 µl Ethanol (96 - 100%), trộn đều.
Bước 4: Chuyển mẫu sang cột có màng lọc, ly tâm 13000 vòng/phút
trong 1 phút. Loại bỏ dịch ở dưới.
Bước 5: Thêm 500µl Buffer AW1, rồi ly tâm 8000 vòng/phút trong 1
phút, bỏ dịch dưới.
Bước 6: Thêm 500µl Buffer AW2, ly tâm 13000 vòng/phút trong 2
phút, bỏ dịch dưới. Tiếp tục ly tâm thêm 1 lần nữa như trên.
Bước 7: Chuyển cột lọc đã giữ lại ADN hệ gen của vi khuẩn trong
màng lọc sang ống Eppendorf loại 1,5ml. Thêm 100 µl Buffer AE, để ở nhiệt độ phịng trong 5 phút. Sau đó ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút, thu dịch lỏng bên dưới, bảo quản ở -20oC.
Cách tiến hành chạy PCR
Mẫu DNA sau khi tách chiết sẽ được hỗn hợp với các thành phần được trình bày ở bảng sau:
Thành phần phản ứng Thể tích cần lấy (μl)
Master mix 2X 12.5
Mẫu DNA chiết tách 5
Primer Forwad 0.5
Primer Reverse 0.5
Nuclease-Free water 6.5
Tổng thể tích 25
Sử dụng cặp mồi đặc hiệu để khuếch đại đoạn gen rnn: OR16S - F1: GAG AAT TAA TTT ACG GAT TAA G; OR16S - R1: TTC GCT TGG TCT CCG AAG AT (Van and Hafez, 1999).
Tên mồi Trình tự nucleotide 5’-3’ Kích thước
Mồi xi AGAATTAATTTACGGATTAAG
784bp
Tiến hành phản ứng khuếch đại sản phẩm trong máy PCR theo chu kỳ nhiệt sau:
Giai đoạn Bước tổng hợp Nhiệt độ (0C) Thời gian Chu kỳ
1 Duỗi mạch 94 5phút 1
2
Duỗi mạch 94 30 giây
45
Gắn mồi 52 60 giây
Tổng hợp sợi mới 72 90 giây
3 Hoàn chỉnh 72 7 phút 1
4 Giữ sản phẩm 4 ∞
Cách tiến hành điện di trên gel agarose đọc kết quả
Bước 1: Chuẩn bị dung dịch đệm và bản gel
- Bản gel được chuẩn bị bằng dung dịch đệm TBE 1X hòa tan với 1,2 gram agarose đặt trong lị vi sóng ở 1000C trong 5 phút, để nguội 45-500C bổ sung 03µl Ethidium bromide (nồng độ 10µg/10µl). Sau đó đổ vào khn có các lược được cài sẵn để tạo bản gel. Khi bản gel đã đông cứng, đặt bản gel vào bể điện di và đổ đung dịch đệm TBE ngập bản gel.
Bước 2: Tra mẫu điện di
Thêm 2 µl loading dye vào 8 µl sản phẩm PCR, trộn đều hỗn dịch bằng pipet và chuyển vào các giếng trong bản thạch. Điện di đồng thời cả thang chuẩn DNA thường sử dụng từ 4-6 µl DNA marker.
Bước 3: Chạy điện di
Nguồn điện trong điện di sử dụng ở hiệu điện thế 100V cường độ 100mA, thời gian chạy điện di trong 30 phút.
Bước 4: Đọc kết quả
Sau khi điện di, vị trí các đoạn DNA được phát hiện bằng máy phát tia UV. Sau đó chụp ảnh và lưu kết quả. Sản phẩm PCR có độ dài 784 bp được điện di trên gel 1,2% trong môi trường TBE 1X.
- Mẫu dương tính với vi rút khi giếng chứa mẫu điện di xuất hiện vạch DNA tương ứng với độ dài đoạn gen nhân lên bp.
- Mẫu âm tính khi khơng xuất hiện vạch DNA tương ứng với độ dài đoạn gen khuếch đại.