2.2.3.1. Loài vật mắc bệnh
Trong tự nhiên virus gây bệnh trên động vật móng guốc chẵn như trâu, bò, dê, cừu, lợn và các động vật hoang dã như: Trâu, bò, lợn rừng, lạc đà, sơn dương, voi. Loài vật ăn thịt ít mắc và thường ở thể nhẹ. Động vật guốc lẻ như ngựa, lừa la không mắc bệnh. Loài chim cũng không cảm nhiễm.
Trong phòng thí nghiệm: chuột lang rất cảm thụ, phương pháp gây nhiễm tốt nhất là tiêm trong da hoặc khía da hay tiêm nội bì gan bàn chân. Sau 12-24 giờ chỗ tiêm có nổi mụn nhỏ, màu đỏ, có thủy thũng, sau 2-3 ngày có thể nhiễm trùng toàn thân và có nhiều mụn ở miệng, lưỡi và lợi (Nguyễn Bá Hiên và Huỳnh Thị Mỹ Lệ, 2013).
2.2.3.2. Chất chứa virus
Trong cơ thể mắc bệnh, virus có nhiều trong các mụn nước, ở hạch lympho, trong máu và các cơ quan nội tạng và bắp thịt. Sau khi nhiễm bệnh 18 giờ virus có trong máu và tồn tại khoảng 3-5 ngày, máu mất độc lực khi các mụn nước được hình thành.
Virus còn có trong các chất bài xuất của vật bệnh như nước bọt, nước tiểu, phân, sữa, nước mắt và nước mũi. Sự lan tràn của virus trong chất bài xuất có trước khi xuất hiện các triệu chứng lâm sàng (Nguyễn Bá Hiên và Huỳnh Thị Mỹ Lệ, 2013).
2.2.3.3. Đường xâm nhập và cách truyền bệnh
Đường xâm nhập chính là tiêu hoá, virus có thể vào cơ thể qua niêm mạc miệng, và niêm mạc ống tiêu hoá. Ngoài ra, các vết trầy ở da, đầu vú cũng là nơi virus xâm nhập vào cơ thể. Đường sinh dục và hô hấp được coi là đường xâm nhập phụ.
Quá trình lây lan bệnh diễn ra theo các cách thức sau:
+ Lây trực tiếp qua nước bọt hoặc các chất bài tiết do nhốt chung hoặc chăn thả chung gia súc bệnh với gia súc khoẻ mạnh.
+ Lây gián tiếp qua thức ăn, nước uống, các dụng cụ chăn nuôi, chân tay, giầy dép của người chăn nuôi, người tham gia điều trị bệnh hoặc lây lan do việc bán chạy các gia súc mắc bệnh, mổ lậu gia súc mắc bệnh, không xử lý đúng mức thịt gia súc mắc bệnh hoặc vận chuyển gia súc mắc bệnh.
+ Virus có thể theo gió phát tán ra không khí trong cự ly 10 km.
2.2.3.4. Cơ chế gây bệnh
Thời kì nung bệnh thường từ 1 – 3 ngày khi gây bệnh thực nghiệm: 2 – 7 ngày hoặc 11 ngày khi gây bệnh trong tự nhiên (Tô Long Thành và cs., 2005)
Virus LMLM xâm nhập vào động vật chủ theo đường hô hấp hoặc theo vết xước trên da, đầu tiên chúng nhân lên với số lượng nhỏ tại nơi xâm nhập (Sobrino F. and Esteban Domingo, 2001)
Vùng yết hầu của động vật nhai lại được coi như vùng sinh bệnh ban đầu của virus LMLM, sau đó virus LMLM xâm nhập vào tổ chức lympho vùng hầu hay các hạch liên quan rồi đi vào máu (Donalsson A.I., 2000).
Sau khi vào máu, virus LMLM được đưa đến các vị trí thứ cấp gồm các cơ quan tuyến, hạch lympho khác và biểu mô quang mồm, chân, nơi phát sinh các mụn nước. Mụn nước dày đặc xuất hiên ở viền móng, vòm khẩu cái, mõm lưỡi, đầu vú (Brown C, 2001).
Virus LMLM có thể qua đường sinh dục, qua các niêm mạc khác, qua da của vành móng (Văn Ðăng Kỳ và Nguyễn Văn Thông, 2011).
2.2.4. Triệu chứng ở lợn
- Thời gian nung bệnh từ 2-12 ngày;
- Lợn sốt cao, kém ăn hoặc bỏ ăn, thở nhiều.
Chân:
- Nặng hơn ở trâu, bò;
- Có biểu hiện què, đi khập khiễng; bệnh nặng hơn do nhiễm tạp khuẩn, lợn có thể bị loét móng và long móng;
- Hình thành mụn nước ở mõm;
- Ít hình thành mụn nước ở miệng, do đó không có hiện tượng chảy nước dãi; - Lợn con đang bú hoặc mới cai sữa thường bị ỉa chảy hoặc chết đột ngột.
2.2.5. Bệnh tích
Theo Huỳnh Thị Mỹ Lệ và cs., (2011) bệnh tích đặc trưng của bênh LMLM là: Hình thành các mụn nước riêng lẻ hoặc tập trung thành đám, có kích thước từ 2mm đến 10cm, tiến triển ở các giai đoạn khác nhau: Đám có màu trắng , hình thành mụn nước. Sau khi vỡ, để lại vết đỏ rớm máu, trên có phủ bựa fibrin màu xám.
Cơ tim biến chất, mềm, dễ nát, có vết trắng xám nhạt hay vàng nhạt. Màng bao tim sưng to, trong chứa màu vàng. Tâm nhĩ có lốm đốm xuất hiện từng mảng. Bệnh tích ở tim thường thấy ở con vật mắc bệnh thể nặng.
Mụn nước mọc ở kẽ móng, xung quanh móng và dễ làm long móng. Các trường bị hợp vật bệnh biến chứng nhiễm khuẩn, thường chân móng bị thối loét. Thời kỳ ủ bệnh thông thường từ 2 – 7 ngày. Sau khi gây bệnh thực nghiệm, các dấu hiệu có thể thấy sớm là trong vòng 12 giờ, còn bình thường là 12 – 48 giờ. Khi động vật cảm thụ tiếp xúc với động vật mắc bệnh lâm sàng (thời điểm đễ làm lây lan bệnh là khi các mụn nước vỡ) thì các dấu hiệu lâm sàng thường xuất hiện trong khoảng 3 – 5 ngày.
2.2.6. Các phương pháp chẩn đoán 2.2.6.1. Chẩn đoán lâm sàng
Để chẩn đoán bệnh LMLM, đầu tiên căn cứ vào các dấu hiệu lâm sàng của bệnh. Tuy nhiên, việc chẩn đoán lâm sàng thường dễ bị nhầm lẫn với các bệnh khác như: bệnh viêm mụn nước (Vesicular stomatitis), bệnh mụn nước ở lợn (Swine vesicular disease), bệnh mụn nước ban đỏ ở lợn (Vesicularexanthema of
swine), bệnh dịch tả trâu, bò, bệnh tiêu chảy siêu trùng ở bò... Do đó để chẩn đoán phân biệt chính xác phải dựa trên chẩn đoán phòng thí nghiệm.
2.2.6.2. Chẩn đoán virus học
Dùng huyễn dịch bệnh phẩm (mụn nước, biểu mô,...) nuôi cấy trên tế bào mẫn cảm (tế bào thận bê, BHK 21...), tiêm cho động vật thí nhiệm (chuột lang, bê...), tiêm nội bì lưỡi bò trưởng thành, rồi theo dõi sự biến đổi của tế bào hoặc triệu chứng, bệnh tích của động vật thí nghiệm, để xác định trong bệnh phẩm có chứa virus hay không.
* Phản ứng kết hợp bổ thể (KHBT).
Nguyên lý: Phản ứng kết hợp bổ thể dùng hai hệ thống: Hệ thống dung khuẩn và hệ thống dung huyết với sự tham gia của bổ thể.
- Huyết thanh miễn dịch của từng type được chế trên chuột lang bằng phương pháp gây tối miễn dịch. Tiêm vắc-xin LMLM của từng type virus LMLM khác nhau vào trong da dưới gan bàn chân chuột lang (mỗi type một chuột) hai lần mỗi lần cách nhau một tháng, sau đó lấy máu, chắt huyết thanh có chứa kháng thể.
- Kháng nguyên là máu gia súc nghi mắc bệnh LMLM hoặc bệnh phẩm cấy vào trong môi trường tổ chức lấy từ tuyến yên của bò hoặc lợn, tế bào thận bê cấy hoặc thận cừu non hoặc các dòng tế bào có độ nhạy tương đương, khi tế bào xuất hiện nhưng dấu hiệu bệnh tích tế bào thì lấy dịch làm phản ứng KHBT. * Phản ứng trung hòa virus.
Cách tiến hành phản ứng: thường tiến hành trong môi trường tế bảo tổ chức nuôi cấy trong các đĩa nhựa nhỏ, đáy bằng, sử dụng các dòng tế bào mẫn cảm như IB-RS-2, BHK-21 hoặc tế bào hệ I của thận lợn hoặc thận cừu.
Huyết thanh được pha ¼, xử lý ở 56ºC trong 30 phút sau đó pha loãng gấp đôi trong đĩa nhựa.
Virus với hiệu giá định trước ở nồng độ 100 TCID50 được cho thêm vào từng giếng một và để ở nhiệt độ 37ºC trong 60 phút để phản ứng trung hòa diễn ra.
- Nhận xét: Phản ứng trung hòa virus rất đặc hiệu và nhạy, chỉ cần 2 – 3 ngày là có kết quả nhưng nếu lượng huyết thanh ít, hiệu giá thấp, dương tính giả có thể xảy ra.
* Phản ứng ELISA
Nguyên lý: Phản ứng ELISA dùng kháng thể hoặc kháng kháng thể gắn enzym cho kết hợp trực tiếp hoặc gián tiếp với kháng nguyên, rồi cho cơ chất vào. Nếu kháng thể tương ứng với kháng nguyên thì kháng thể hoặc kháng kháng thể gắn enzym không bị rửa trôi, enzym sẽ phân giải cơ chất tạo nên màu, khi so màu trong quang phổ kế sẽ định lượng được mức độ phản ứng (Nguyễn Như Thanh, 1974).
2.2.6.3. Chẩn đoán bệnh bằng phương pháp sinh học phân tử * Phương pháp RT- PCR
Đối với virus LMLM, trước khi tiến hành PCR thông thường, RNA của virus cần được chuyển thành cDNA nhờ enzymeReverse Transcriptase. Phương pháp PCR như vậy được gọi là RT-PCR. RT-PCR được áp dụng rộng rãi trong chẩn đoán nhanh và định type virus LMLM. Phương pháp đặc biệt có ý nghĩa trong chẩn đoán phân biệt bệnh LMLM và bệnh mụn nước do virus ở lợn.
Phương pháp RT-PCR đang được coi là phương pháp nhanh, nhậy và chính xác, có thể áp dụng cho các loại mẫu khác nhau (Alexandersen et al., 2003) Nguyên lý của phương pháp này là phát hiện vật liệu di truyền của virus dựa trên phản ứng RT-PCR sử dụng các cặp mồi đặc hiệu.
* Phương pháp phân loại dựa trên cây phát sinh chủng loại (phylogenetic tree) Phân loại virus LMLM dựa trên cây phát sinh chủng loại (phylogenetic tree) đang dần thay thế các phương pháp truyền thống dựa trên tiêu chuẩn huyết thanh học. Các cây phát sinh chủng loại được xây dựng trên cơ sở trình tự nucleotide được khuếch đại bằng RT-PCR từ ARN của các chủng virus LMLM đã được phân lập. Thông thường người ta sử dụng các gen mã hóa cho capsid protein, đặc biệt là gen VP1. Ví dụ nhờ phương pháp này mà người ta xác định được quan hệ di truyền giữa các chủng virus phân lập type O có nguồn gốc từ Châu Á, lây lan sang phương tây và phương đông, gây nên đợt dịch LMLM ở Châu Âu 2001/2002. Đợt dịch đã cho thấy sự lây lan nhanh chóng của virus LMLM từ Châu Á sang Châu Âu và làm tăng thêm mối lo ngại về đại dịch LMLM mang tính toàn cầu (Sobrino et al., 2001; Valarcher et al., 1987).
* Kỹ thuật giải trình tự gen
Giải trình tự gen (DNA sequencing) là phương pháp xác định vị trí sắp xếp các nucleotide trong phân tử DNA. Giải trình tự bộ gen người, động vật và vi
sinh vật giúp chẩn đoán bệnh tật và nhiều ứng dụng trong thực tiễn sản xuất, phục vụ lợi ích con người. Có 3 nhóm phương pháp giải trình tự gen chủ yếu: phương pháp Maxam và Gilbert, phương pháp dideoxy (còn gọi là phương pháp Sanger) và phương pháp giải trình tự gen bằng máy tự động.
2.2.7. Phòng bệnh
Việc phòng bệnh LMLM ngoài việc vệ sinh phòng bệnh theo đúng quy định của Ngành thú y thì việc phòng bệnh bằng vắc xin là một giải pháp hữu hiệu nhất.
Để có hiệu quả tiêm phòng phải sử dụng vắc-xin LMLM có hiệu lực, tương đồng về các chủng kháng nguyên chống các chủng virus đang gây bệnh hoặc đe dọa sẽ gây bệnh.Yêu cầu phải tiêm vắc-xin đúng type hoặc subtype gây bệnh, tiêm đúng kỹ thuật để cho miễn dịch tối ưu, kết quả tiêm phòng phải đạt ít nhất là 80% so với tổng đàn gia súc dễ nhiễm trong vùng tiêm.
Các loại vắc-xin LMLM hiện dùng ở Việt Nam
Tại Việt Nam hiện chưa tự sản xuất được vắc xin LMLM mà phải nhập nước ngoài dưới hai hình thức là nhập nguyên vắc xin từ nước ngoài và nhập về gói lại. Hiện nay, nước ta đang sử dụng 2 loại vắc-xin đơn giá và đa giá nhập từ các nước là Merial (Pháp) và Intervet (Hà Lan), Trung Quốc (vắc-xin vô hoạt type O), Nga, Ấn Độ (Posi-FMD).
Intervet giới thiệu ở Việt Nam 2 loại vắc-xin LMLM có tên thương mại là DECIVAC- FMD- ALSA (dùng cho thú nhai lại).
Viện Thú y Lan Châu, Trung Quốc có vắc-xin nhị giá Foot and Mouth Disease (type O, Asia 1) Bivalent Vaccine, Inactivated cũng đang được sử dụng ở nước ta.
Vắc-xin đa giá đang được sử dụng Việt Nam chứa các type O, A và Asia 1.
2.2.8. Điều trị
- Hiện nay chưa có thuốc đặc trị bệnh LMLM, chỉ có thuốc chữa triệu chứng.
- Chữa triệu chứng:
* Mục đích: nhằm ngăn chặn, loại trừ vi khuẩn kế phát.
- Chữa miệng: Dùng các chất sát trùng nhẹ, các loại quả chua như khế, chanh bóp mềm, rưới nước (hoặc bơm xịt nước), trà đi, sát lại ở lưỡi, mặt trong
má, hàm trên, lợi, bỏ bã vào miệng cho con vật nhai. Dùng vải mỏng thấm nước nói trên xoa vào vùng vết thương 2 – 3 lần/ngày và xoa trong vòng 4 – 5 ngày. Có thể dùng một trong các chất như: xanh Methylen 1%, thuốc tím 1%, Formol1%, phèn chua 3%, axit acetic 3% hoặc dùng thuốc mỡ Tetracilin, Penicilin bôi vào vết thương.
PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. ĐỐI TƯỢNG, ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU 3.1.1. Đối tượng nghiên cứu
Virus LMLM phân lập được từ mẫu bệnh phẩm của lợn nghi mắc bệnh LMLM thu thập được ở tỉnh Hà Nam, Bắc Ninh, Thái Nguyên, Bắc Giang, Hà Nội, Hải Dương.
3.1.2. Vật liệu nghiên cứu 3.1.2.1. Mẫu bệnh phẩm 3.1.2.1. Mẫu bệnh phẩm
Mẫu bệnh phẩm trong nghiên cứu này (gồm biểu mô móng kẽ chân, biểu mô lưỡi) được lấy từ những con lợn nghi mắc bệnh LMLM với những biểu hiện triệu chứng đặc trưng của bệnh LMLM.
3.1.2.2. Sinh phẩm, hóa chất dùng cho tách chiết RNA
- TRIzol Reagent (Invitrogen) - Chloroform
- Isopropanol
- Ethanol 70% pha trong nước đã xử lý với DEPC. - H2O đã xử lý DEPC
3.1.2.3. Cặp mồi (primer) và kit PCR
Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng kit SuperScript III One-Step RT-PCR System with Platinum Taq DNA Polymerase (Life Technologies, USA) với tỷ lệ thành phần theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
Bảng 3. 1. Trình tự cặp mồi dùng trong chẩn đoán và định type virus Lở mồm long móng
STT Tên mồi Trình tự mồi (5’ - 3’) Type Sản phẩm
PCR (bp)
1 1F GCCTGGTCTTTCCAGGTCT O, A, Asia 1 328
2 1R CCAGTCCCCTTCTCAGATC
3 VN-VP1R CATGTCYTCYTGCATCTGGTT O, A, Asia 1
4 VN-OF AGATTTGTGAAAGTDACACCA O 658
5 VN-As1F GCGSTHRYYCACACAGGYCCGG Asia 1 535
3.1.2.4. Tế bào, hóa chất dùng cho nuôi cấy tế bào và phân lập virus
- Tế bào BHK-21 do phòng AVAC Lab công ty TNHH MTV AVAC Việt Nam cung cấp;
- Môi trường DMEM (Dullbeco Minimum Essential Medium Eagle); - Huyết thanh bào thai bê (Fetal Bovine Serum, FBS) (Sigma); - Trypsin- EDTA 1X (Sigma);
- Đệm PBS (-) (Phosphate Buffered Saline) (Sigma); - Ngoài ra còn có cồn sát trùng 70°, cồn 90°, chloraminB…
3.1.2.5. Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm * Dụng cụ
- Dụng cụ lấy mẫu: xilanh lấy mẫu, lọ đựng mẫu, túi nylon, đá khô…; - Pipette vô trùng loại: 2ml, 5ml, 10ml (Corning);
- Đầu típ vô trùng (10μl, 20μl, 200μl, 1000μl) (Sorenson); - Pipette aid (GenMate);
- Multipipette: 8 kênh (GenMate);
- Micropipette: 10μl, 20μl, 200μl, 1000μl (GenMate); - Chai nuôi tế bào T25, T75 (Corning);
- Đĩa 96 giếng vô trùng nuôi tế bào (Corning); - Ống ly tâm 50 ml (Corning);
- Ống ly tâm 15 ml (Corning);
- Ống Eppendorf 1,5 ml; 0,5 ml; 0,2 ml (Sorenson); - Màng lọc vô trùng 0,45μm (Sartorius);
- Parafilm M, thanh khuấy từ (Brand);
- Găng tay, khẩu trang, đèn cồn, bông gòn, bật lửa; - Cốc đong thủy tinh 250ml, 500ml,…
* Trang thiết bị
- Tủ an toàn sinh học cấp độ II (Safety cabinet level 2); - Máy lọc môi trường (Milipore);
- Máy khuấy từ có gia nhiệt (Velp Scientifica);
- Máy ly tâm lạnh Centrifuge 5417C (Eppendorf) (tube ly tâm 1,5ml); - Máy ly tâm EBA 12 (Hettich Zentrifugen) (cho tube ly tâm 15ml); - Máy ly tâm Centrifuge 5804R (Eppendorf) (cho tube ly tâm 50ml); - Máy trộn (vortex) LaborA (Bioblock Scientific);
- Bộ nguồn điện di EC 105 (APPARATUS); - Bể ổn nhiệt Polystat (Bioblock Scientific); - Tủ ấm có CO2 (Sanyo) và không CO2 (Jouan); - Tủ đông sâu -80oC (Sanyo);
- Kính hiển vi soi ngược (Olympus); - Tủ lạnh thường và tủ lạnh -20oC (Sanyo); - Bình nitơ bảo quản tế bào (Locator); - Nồi hấp tiệt trùng (ALP);
- Cân phân tích BP61 (Satorius);
- Máy hút chân không, tủ sấy, máy ảnh…
3.1.3. Địa điểm nghiên cứu
- Địa điểm xét nghiệm: Phòng thí nghiệm Nghiên cứu và Phát triển (AVAC Lab), Công ty TNHH MTV AVAC Việt Nam.
- Địa điểm giải trình tự gene: Công ty Marcrogen, Hàn Quốc.
3.1.4. Thời gian nghiên cứu
Đề tài được thực hiện từ 12/2015 đến 4/2017.
3.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
3.2.1. Chẩn đoán các chủng virus LMLM bằng sinh học phân tử
- Thu thập mẫu;
- Chẩn đoán định tính virus LMLM; - Chẩn đoán định type virus LMLM.
3.2.2. Nghiên cứu đặt tính sinh học của các chủng virus LMLM type O phân lập được tại miền bắc Việt Nam