Phần 3 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
3.3. Phương pháp nghiên cứu
3.3.1. Phương pháp thu thập và xử lý mẫu
viêm loét... Mẫu thu được sẽ tiến hành đồng nhất: dùng chày cối sứ đồng nhất hoàn toàn huyễn dịch bệnh phẩm, sau đó bổ sung môi trường DMEM không có FBS (hoặc PBS 1X) thành huyễn dịch 10%. Chuyển huyễn dịch bệnh phẩm vào ống eppendorf 1,5 ml. Ly tâm 4000 vòng/1 phút ở nhiệt độ 4°C trong 10 phút. Dùng pipete hút phần dịch trong sau ly tâm và bảo quản ở -20oC cho các nghiên cứu tiếp theo.
3.3.2. Phương pháp tách chiết RNA từ mẫu bệnh phẩm
Các bước tách chiết ARN từ mẫu huyết thanh/huyễn dịch bệnh phẩm gồm: - Cho 700µl TRIzol Reagent vào 300µl dung dịch mẫu, vortex trộn đều, ủ ở nhiệt độ phòng 5 phút;
- Bổ sung 200µl Chloroform, vortex mạnh trong 15 giây, ủ 10 phút ở nhiệt độ phòng;
- Ly tâm 12.000 vòng/phút/4oC trong vòng 10 phút;
- Hút khoảng 500µl dịch nổi (chứa ARN) và bổ sung 500µl Isopropanol. Đảo ống bằng tay khoảng 15 giây. Ủ hỗn dịch ở nhiệt độ phòng trong 10 phút;
- Ly tâm 12.000 vòng/phút/4oC trong vòng 10 phút; - Loại bỏ Isopropanol, giữ lại tủa ARN;
- Rửa tủa ARN bằng 1 ml cồn 70% bằng cách đảo nhẹ ống. Ly tâm 12.000 vòng/ 15 phút ở 4oC;
- Loại bỏ hoàn toàn cồn 70%, làm khô tủa ARN tự nhiên ở nhiệt độ phòng trong 5-10 phút;
- Hòa tan tủa ARN trong 30µl H2O đã xử lý RNase. Sử dụng trực tiếp hoặc Bảo quản ở -20oC.
3.3.3. Phương pháp One-step RT-RCR
Thành phần phản ứng bao gồm:
Bảng 3.2. Thành phần phản ứng RT-PCR
Thành phần Thể tích (µl)
Nước tinh khiết 6.5
2X Reaction Mix 12.5
Mồi xuôi (Sense primer) (10 μM) 1
Mồi ngược (Anti-sense primer) (10 μM) 1
SuperScript III RT/ Platinum Taq Mix* 1
RNA sợi khuôn (0.01 pg–1 μg) 3
* Tiến hành
Lấy lượng thành phần như trên cho vào ống PCR 0,2ml, trộn đều. Đặt ống PCR trên vào máy PCR, với theo chu trình nhiệt như sau:
Bảng 3.3. Chu trình nhiệt của phản ứng RT-PCR
Hoạt động Nhiệt độ Thời gian Chu kỳ
Phiên mã ngược 50oC 30 phút 1
Biến tính 94oC 2 phút 1
Tháo xoắn 94oC 15 giây
40
Gắn mồi 50oC 30 giây
Kéo dài 68 oC 1 phút
Hoàn thành 68 oC 5 phút 1
Giữ sản phẩm 4oC ∞
* Kiểm tra sản phẩm PCR bằng chạy điện di
Bước 1: Chuẩn bị dung dịch agarose 1% trong đệm 1X TBE, bằng cách cân 0,25g bột agarose cho vào 25ml dung dịch 1X TBE. Đun nóng dung dịch 1% agarose tan trong 2 phút. Để nguội dung dịch tới khoảng 45-50oC. Bổ sung thêm 1.5µl dung dịch thuốc nhuộm Safe view, lắc đều hỗn dịch. Đổ gel vào khuôn đã được cắm lược trước, để yên khoảng 30 phút cho tới khi gel đông lại, tháo lược ra. Đổ dung dịch chạy điện di 1X TBE vào trong khoang điện di có chứa gel agarose vừa đổ sao cho ngập bản gel.
Bước 2: Lấy 1µl loading dye 6x + 5µl sản phẩm PCR, trộn đều.
Bước 3: Tra marker, tra đối chứng dương, đối chứng âm và, tra hỗn hợp các sản phẩm PCR + loading dye ở trên vào các giếng trên bản gel.
Bước 4: Chạy điện di ở 100V trong 30 phút.
Bước 5: Lấy gel ra cho vào máy UV-Transiluminator, nếu xuất hiện băng DNA đúng kích thước kết quả là dương tính, ngược lại là kết quả âm tính. Chụp kết quả lại bằng máy ảnh.
3.3.4. Phương pháp phân lập virus LMLM trên môi trường tế bào BHK-21 3.3.4.1. Chuẩn bị tế bào BHK-21 3.3.4.1. Chuẩn bị tế bào BHK-21
* Phục hồi tế bào từ Ni tơ lỏng
Để tạo điều kiện cho virus nhân lên tốt trên tế bào, cần sử dụng tế bào BHK-21 với mật độ tế bào phủ đáy khoảng > 80%.
Dòng tế bào BHK-21 được bảo quản trong nitơ lỏng, phục hồi tế bào theo các bước sau:
Rã đông: Lấy ống tế bào BHK-21 từ bình nitơ lỏng, ngâm vào bể ổn nhiệt (Benchmark) cài nhiệt độ nước trong bể ở 37 °C, chờ đến khi dịch tan hết thì lấy ra. Theo nguyên tắc đông tan nhanh để loại bỏ DMSO (chất bảo quản màng tế bào)
Dùng pipette chuyển lượng tế bào bên trong ống cất tế bào sang ống Fancol 15ml, cho thêm 5 ml môi trường DMEM chầm chậm từng giọt một. Dùng pipette trộn nhẹ để hỗn hợp hòa đều với nhau.
Ly tâm 1000 vòng/ trong 5 phút. Sau đó hút bỏ phần dịch ở bên trên, búng đều vào đáy ống Fancol để các tế bào tách rời nhau.
Hòa cặn tế bào trong 5 ml môi trường nuôi cấy tế bào DMEM có bổ sung 5% FBS.
Chuyển huyễn dịch tế bào (5 ml) vào chai nuôi cấy tế bào (chai T25), ghi các thông tin liên quan (số đời cấy truyền tế bào BHK-21, ngày giờ nuôi cấy).
Hàng ngày quan sát sự phát triển của tế bào trên kính hiển vi soi ngược. * Nhân số lượng tế bào
Khi tế bào phủ 80-90% bề mặt đáy chai nuôi, tiến hành tách tế bào bám dính và cấy chuyển như sau:
- Loại bỏ môi trường trong chai nuôi cấy tế bào và rửa tế bào bằng dung dịch PBS 1X vô trùng.
- Cho 0,5 ml dung dịch trypsin-EDTA (trypsin-EDTA 1x, Invitrogen) vào chai nuôi cấy tế bào dùng tay lắc đều láng đều trypsin khoảng 2-3 phút, quan sát trên kính hiển vi thấy tế bào co tròn tách khỏi đáy chai. Thêm 6 ml môi trường nuôi cấy DMEM có bổ sung 5% FBS, trộn đều, chuyển sang ống corning 15 ml.
- Ly tâm huyễn dịch tế bào 2000 vòng trong 10 phút, loại bỏ phần dịch ở trên, giữ lại cặn tế bào.
- Hòa cặn tế bào trong 12 ml môi trường DMEM có bổ sung 5% FBS, đếm tế bào và pha loãng tế bào để có nồng độ 2x105 tế bào/ml trong môi trường nuôi cấy DMEM có bổ sung 5% FBS.
* Đếm tế bào bằng buồng đếm Neubauter:
+ Trộn 100 µl huyễn dịch tế bào và 900 µl thuốc nhuộm trypan blue 0,22% (tỷ lệ pha 1/10).
+ Đưa hỗn hợp thuốc nhuộm và tế bào này lên buồng đếm bằng cách chạm đầu hút có chứa hỗn hợp vào chỗ tiếp giáp giữa buồng đếm và lamella. + Chỉ đếm những tế bào còn sống (màu vàng nhạt, có điểm sáng ở giữa), không đếm những tế bào chết (bắt màu xanh). Vùng đếm là 4 ô vuông lớn (ký hiệu L).
+ Cách tính kết quả:
n x d x 104 Số tế bào trong 1 ml: C =
4 Trong đó: C: số tế bào trong 1 ml
n: số tế bào trong 4 ô vuông d: nồng độ pha loãng
- Chia huyễn dịch tế bào vào hai chai nuôi tế bào mới (5 ml/chai T25) và đĩa nuôi cấy tế bào 96 giếng (Ghi thông tin vào các chai nuôi tế bào như tên dòng tế bào, ngày nuôi cấy, lần cấy chuyển).
- Nuôi tế bào ở 37°C/5% CO2, theo dõi thường xuyên sự phát triển của tế bào bằng kính hiển vi soi ngược. Khi tế bào phát triển thành một lớp ở đáy chai thì tiến hành gây nhiễm virus LMLM.
3.3.4.2. Gây nhiễm tế bào
- Làm ấm môi trường DMEM có bổ sung 5% FBS, PBS, Trypsin trong bể ổn nhiệt 37oC trong 15 phút
- Loại bỏ môi trường nuôi cấy cũ ra khỏi chai nuôi cấy tế bào
- Rửa loại bỏ hết tế bào chết trong chai bằng 5ml PBS 1X/ chai T25. Dùng bình hút chân không loại bỏ PBS 1X.
- Dùng lọc vô trùng 0,45 µm lọc 0,5ml huyễn dịch bệnh phẩm 10% vào chai T25. Láng đều huyễn dịch bệnh phẩm trên thảm tế bào
- Ký hiệu mẫu, ngày phân lập, loại tế bào, tình trạng phân lập - Lắc huyễn dịch mẫu + tế bào bằng máy lắc (Sharking) trong 1h - Loại bỏ hoàn toàn huyễn dịch gây nhiễm
- Bổ sung 5ml môi trường nuôi cấy tế bào DMEM/ chai T25. Nuôi tế bào ở 37oC, 5% CO2
- Theo dõi bệnh tích tế bào (CPE) hằng ngày. Sau 4 ngày, xác định sự có mặt của virus trong chai nuôi cấy tế bào bằng cách quan sát CPE dưới kính hiển vi: các tế bào co tròn lại, chụm lại từng đám giống chùm nho, khi tế bào bị virus
phá hủy hoàn toàn thì bong khỏi đáy giếng. Thường thấy bệnh tích xuất hiện ở đời thứ 2, thứ 3 của những lần gây nhiễm.
3.3.4.3. Phương pháp thu dịch tế bào:
- Để chai nuôi cấy tế bào sau khi gây nhiễm 72 đến 96 h vào tủ âm sâu - 80°C khoảng 1h, sau đó lấy ra đánh nhẹ vào lòng bàn tay để tế bào bong hết ra rồi để ở nhiệt độ phòng để rã đông tế bào và môi trường. Lặp lại thao tác này thêm 2 lần nữa.
- Hút toàn bộ môi trường trong các giếng vào các ống fancol 15 ml có ghi tên khác nhau để ly tâm thu dịch virus. Ly tâm 3000 vòng/10 phút. Hút phần dịch bên trên vào các ống eppendorf 1,7 ml vô trùng có ghi tên, ký hiệu cho mỗi mẫu riêng rồi cất trong tủ lạnh sâu -80 0C.