Phần 4 Kết quả nghiên cứu và thảo luận
4.2. Kết quả phân lập và xác định một số đặc điểm sinh học của virus LMLM
4.2.1. Kết quả phân lập virus và xác định khả năng gây bệnh tích tế bào qua các
các đời cấy chuyển
Bốn mẫu bệnh phẩm dương tính với virus LMLM type O được xử lý sau đó gây nhiễm trên tế bào BHK- 21 và được nuôi trong môi trường DMEM với 5% FBS ở các chai nuôi cấy tế bào T25 cm2. Sau khi gây nhiễm virus chai nuôi cấy tế bào được bổ sung 5ml môi trường DMEM có 5% FBS đặt trong tủ ấm 37°C, 5% CO2. Bệnh tích trên tế bào được quan sát tại các thời điểm 24h, 48h, 72h dưới kính hiển vi soi ngược.
Chúng tôi đánh giá khả năng gây bệnh tích trên tế bào của virus LMLM theo mức độ phần trăm tế bào bị phá hủy. Khi chưa thấy bệnh tích xuất hiện trên bề mặt đáy chai tế bào thì CPE là 0% ngược lại khi toàn bộ tế bào trong chai nuôi bị co lại và bong ra khỏi đáy chai nuôi cấy thì CPE đạt 100%. Đối chứng âm được duy trì trong quá trình gây nhiễm là chai tế bào BHK-21 với 5ml môi trường DMEM + 5% FBS không có dịch virus để làm cơ sở tham chiếu với chai đã gây nhiễm virus.
Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành gây nhiễm 4 mẫu virus trên 3 đời liên tiếp. Kết quả theo dõi tỷ lệ tỷ lệ tế bào bị phá hủy theo đời gây nhiễm và theo thời gian được thể hiện ở bảng 4.3 dưới đây:
Qua kết quả thu được ở bảng 4.3 cho thấy: * Đối với chủng O/VN/BN/2016:
Ở đời thứ nhất, tế bào sau khi tiến hành gây nhiễm virus, ở thời điểm 24; 48 và 72 giờ, đều không quan sát được bệnh tích trên tế bào.
Ở đời thứ 2, tế bào sau khi gây nhiễm virus, ở thời điểm 24 giờ, có 15% lượng tế bào bị phá hủy, thời điểm sau 48 giờ có 35% lượng tế bào bị phá hủy và sau 72 giờ, lượng tế bào bị phá hủy là 70%.
Ở đời thứ 3, khả năng gây bệnh tích tế bào của mẫu O/VN/BN/2016 cao hơn so với đời thứ 1 và 2. Cụ thể, sau 24 giờ có 20% lượng tế bào bị phá hủy, sau 48 giờ và 72 giờ có 80% lượng tế bào bị phá hủy.
Bảng 4.3. Kết quả gây nhiễm 4 mẫu virus LMLM trên môi trường tế bào BHK-21
TT Tên chủng Đời gây
nhiễm Tỷ lệ tế bào bị phá hủy (%) Kết quả CPE 24h 48h 72h 1 O/VN/BN/2016 P1 0 0 0 - P2 15 35 70 + P3 20 80 80 + 2 O/VN/BG1/2016 P1 0 25 50 + P2 30 45 80 + P3 40 90 90 + 3 O/VN/HD/2016 P1 15 40 60 + P2 30 55 80 + P3 30 90 90 + 4 O/VN/BG2/2016 P1 0 25 50 + P2 20 50 70 + P3 30 80 85 + Chú thích: (+): có bệnh tích , (±): bệnh tích nghi ngờ, (-): không có bệnh tích
* Đối với mẫu O/VN/BG1/2016
Ở đời thứ nhất, tế bào sau khi tiến hành gây nhiễm virus, ở thời điểm 24 giờ, không quan sát được bệnh tích trên tế bào. Tuy nhiên, sau 48 giờ, lượng tế bào bị phá hủy chiếm 25% và sau 72 giờ lượng tế bào bị phá hủy là 50%.
Ở đời thứ 2, tế bào sau khi gây nhiễm virus, ở thời điểm 24 giờ, có 30% lượng tế bào bị phá hủy, thời điểm sau 48 giờ có 45% lượng tế bào bị phá hủy và sau 72 giờ, lượng tế bào bị phá hủy là 80%.
Ở đời thứ 3, khả năng gây bệnh tích tế bào của chủng O/VN/BG1/2016 cao hơn so với đời thứ 1 và 2. Cụ thể, sau 24 giờ có 40% lượng tế bào bị phá hủy, sau 48 giờ và 72 giờ có 90% lượng tế bào bị phá hủy.
* Đối với chủng O/VN/HD/2016
Ở đời thứ nhất, tế bào sau khi tiến hành gây nhiễm virus, ở thời điểm 24 giờ, có 15% lượng tế bào bị phân hủy. Sau 48 giờ, lượng tế bào bị phá hủy chiếm 40% và sau 72 giờ lượng tế bào bị phá hủy là 60%.
Ở đời thứ 2, tế bào sau khi gây nhiễm virus, ở thời điểm 24 giờ, có 30% lượng tế bào bị phá hủy, thời điểm sau 48 giờ có 55% lượng tế bào bị phá hủy và sau 72 giờ, lượng tế bào bị phá hủy là 80%.
Ở đời thứ 3, khả năng gây bệnh tích tế bào của chủng O/VN/HD/2016 cao hơn so với đời thứ 1 và 2. Cụ thể, sau 24 giờ có 30% lượng tế bào bị phá hủy, sau 48 giờ và 72 giờ có 90% lượng tế bào bị phá hủy.
* Đối với chủng O/VN/BG2/2016
Ở đời thứ nhất, sau khi tiến hành gây nhiễm virus lên tế bào, ở thời điểm 24 giờ, chưa có biểu hiện gây bệnh tích tế bào. Sau 48 giờ, lượng tế bào bị phá hủy chiếm 25% và sau 72 giờ lượng tế bào bị phá hủy là 50%.
Ở đời thứ 2, ở thời điểm 24 giờ sau khi gây nhiễm virus lên tế bào, có 20% lượng tế bào bị phá hủy, thời điểm sau 48 giờ có 50% lượng tế bào bị phá hủy và sau 72 giờ, lượng tế bào bị phá hủy là 70%.
Ở đời thứ 3, khả năng gây bệnh tích tế bào của chủng O/VN/HD/2016 cao hơn so với đời thứ 1 và 2. Cụ thể, sau 24 giờ có 30% lượng tế bào bị phá hủy, sau 48 giờ có 80% lượng tế bào bị phá hủy và sau 72 giờ có 85% lượng tế bào bị phá hủy.
Trong nghiên cứu này, virus LMLM thường được nhân lên tương đối sớm từ những đời gây nhiễm đầu tiên sau 24h là có thể quan sát được bệnh tích tế bào, thường muộn nhất là đến đời thứ 5 là có thể quan sát thấy bệnh tích rõ ràng.
Như vậy sau 3 đời gây nhiễm cả 4 mẫu virus đều gây bệnh tích tế bào, virus phát triển mạnh nhất tại thời điểm 48 giờ với 80-90% tế bào bị co tròn bệnh tích tế bào rõ nét nhất. Trong quá trình quan sát bệnh tích tế bào dưới kính hiển vi ở vật kính 40 X những hình ảnh đặc trưng nhất được chụp lại, và hình 4.3 là ảnh bệnh tích tế bào của 4 mẫu virus ở đời thứ 3 thời điểm 48 giờ.
Đối chứng tế bào BHK-21 Tế bào BHK-21 gây nhiễm virus
Hình 4.3. Kết quả theo dõi gây nhiễm của 4 chủng LMLM trên tế bào BHK-21 trên tế bào BHK-21 O/VN/BN/2016 ĐC ĐC O/VN/BG1/2016 ĐC O/VN/HD/2016 O/VN/BG2/2016 ĐC
Quan sát CPE bằng kính hiển vi soi ngược cho thấy ở những giờ đầu xuất hiện bệnh tích cụ thể sau 24 giờ: Một số tế bào bị co tròn tỷ lệ khoảng 30%, phần lớn tế bào còn lại vẫn bám đáy chai. Sau 48 giờ tỷ lệ tế bào bị phá hủy dày đặc hơn, tế bào co tròn thành chùm nho xuất hiện nhiều hơn tạo thành những mảng bong ra khỏi đáy chai, tỷ lệ tế bào còn bám lại ở đáy chai còn khoảng 30%. Sau 72 giờ gây nhiễm tế bào bị bong ra khỏi đáy chai, lơ lửng trong môi trường nuôi cấy có thể quan sát bằng mắt thường những lấm tấm nhỏ.