3.1.2.1. Mẫu bệnh phẩm
Mẫu bệnh phẩm trong nghiên cứu này (gồm biểu mô móng kẽ chân, biểu mô lưỡi) được lấy từ những con lợn nghi mắc bệnh LMLM với những biểu hiện triệu chứng đặc trưng của bệnh LMLM.
3.1.2.2. Sinh phẩm, hóa chất dùng cho tách chiết RNA
- TRIzol Reagent (Invitrogen) - Chloroform
- Isopropanol
- Ethanol 70% pha trong nước đã xử lý với DEPC. - H2O đã xử lý DEPC
3.1.2.3. Cặp mồi (primer) và kit PCR
Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng kit SuperScript III One-Step RT-PCR System with Platinum Taq DNA Polymerase (Life Technologies, USA) với tỷ lệ thành phần theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
Bảng 3. 1. Trình tự cặp mồi dùng trong chẩn đoán và định type virus Lở mồm long móng
STT Tên mồi Trình tự mồi (5’ - 3’) Type Sản phẩm
PCR (bp)
1 1F GCCTGGTCTTTCCAGGTCT O, A, Asia 1 328
2 1R CCAGTCCCCTTCTCAGATC
3 VN-VP1R CATGTCYTCYTGCATCTGGTT O, A, Asia 1
4 VN-OF AGATTTGTGAAAGTDACACCA O 658
5 VN-As1F GCGSTHRYYCACACAGGYCCGG Asia 1 535
3.1.2.4. Tế bào, hóa chất dùng cho nuôi cấy tế bào và phân lập virus
- Tế bào BHK-21 do phòng AVAC Lab công ty TNHH MTV AVAC Việt Nam cung cấp;
- Môi trường DMEM (Dullbeco Minimum Essential Medium Eagle); - Huyết thanh bào thai bê (Fetal Bovine Serum, FBS) (Sigma); - Trypsin- EDTA 1X (Sigma);
- Đệm PBS (-) (Phosphate Buffered Saline) (Sigma); - Ngoài ra còn có cồn sát trùng 70°, cồn 90°, chloraminB…
3.1.2.5. Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm * Dụng cụ
- Dụng cụ lấy mẫu: xilanh lấy mẫu, lọ đựng mẫu, túi nylon, đá khô…; - Pipette vô trùng loại: 2ml, 5ml, 10ml (Corning);
- Đầu típ vô trùng (10μl, 20μl, 200μl, 1000μl) (Sorenson); - Pipette aid (GenMate);
- Multipipette: 8 kênh (GenMate);
- Micropipette: 10μl, 20μl, 200μl, 1000μl (GenMate); - Chai nuôi tế bào T25, T75 (Corning);
- Đĩa 96 giếng vô trùng nuôi tế bào (Corning); - Ống ly tâm 50 ml (Corning);
- Ống ly tâm 15 ml (Corning);
- Ống Eppendorf 1,5 ml; 0,5 ml; 0,2 ml (Sorenson); - Màng lọc vô trùng 0,45μm (Sartorius);
- Parafilm M, thanh khuấy từ (Brand);
- Găng tay, khẩu trang, đèn cồn, bông gòn, bật lửa; - Cốc đong thủy tinh 250ml, 500ml,…
* Trang thiết bị
- Tủ an toàn sinh học cấp độ II (Safety cabinet level 2); - Máy lọc môi trường (Milipore);
- Máy khuấy từ có gia nhiệt (Velp Scientifica);
- Máy ly tâm lạnh Centrifuge 5417C (Eppendorf) (tube ly tâm 1,5ml); - Máy ly tâm EBA 12 (Hettich Zentrifugen) (cho tube ly tâm 15ml); - Máy ly tâm Centrifuge 5804R (Eppendorf) (cho tube ly tâm 50ml); - Máy trộn (vortex) LaborA (Bioblock Scientific);
- Bộ nguồn điện di EC 105 (APPARATUS); - Bể ổn nhiệt Polystat (Bioblock Scientific); - Tủ ấm có CO2 (Sanyo) và không CO2 (Jouan); - Tủ đông sâu -80oC (Sanyo);
- Kính hiển vi soi ngược (Olympus); - Tủ lạnh thường và tủ lạnh -20oC (Sanyo); - Bình nitơ bảo quản tế bào (Locator); - Nồi hấp tiệt trùng (ALP);
- Cân phân tích BP61 (Satorius);
- Máy hút chân không, tủ sấy, máy ảnh…