Các xét nghiệm về chuyển hóa sắt như Ferritin, sắt huyết thanh, SGOT, SGPT, Ure, Creatinin tại Khoa hóa sinh, Bệnh viện Nhi trung ương.
2.2.5. Phát hiện và phân tích đột biến gen β-globin
Khoa sinh học phân tử, Bệnh viện Nhi trung ương. Quy trình phát hiện đột biến gen ở đây đã được công nhận chất lượng BOA (Bureau of Accreditation), cấp chứng chỉ đạt tiêu chuẩn ISO 15189 : 2012.
- Thu thập mẫu máu và tách DNA từ máu ngoại biên bệnh nhân. Lấy 2ml máu ngoại biên từ tĩnh mạch, vô khuẩn và chống đông bằng EDTA 1,5mg/ml.
- Tách DNA tổng số từ máu ngoại vi, sử dụng bộ kít tách DNA thương mại QIA gen DNA blood miniket của Đức. DNA tổng số sau khi tách chiết được đo nồng độ và độ tinh sạch bằng máy Nano drop (Thermo). Nồng độ DNA tổng số > 30ng, độ tinh sạch 260/280 = 1,7 – 1,9.
- Kỹ thuật PCR phát hiện đột biến gen β-globin:
Kỹ thuật Multiplex ARMS-PCR là các kỹ thuật được thiết lập để xác định các đột biến điểm gen β-globin. Cho đến nay đã phát hiện trên 200 đột biến gen β- globin, bao gồm đột biến tác động đến từng bước phiên mã gen HBB (transcription of β-globin gene), tiến trình hoàn thiện RNA (RNA processing) và dịch mã RNA (RNA translation). Hầu hết đột biến gen HBB là đột biến điểm. Chúng tôi chọn 9 đột biến điểm thường gặp ở khu vực Đông Nam Á [112] để phát hiện sàng lọc bằng kỹ thuật Multiplex ARMS-PCR; đó là CD41/42 (-TCTT), CD17 (AAG→TAG), IVS 1-1 (G-T), -28 (A→G), IVS2.654 (C-T), CD71/72 (+A), IVS 1-5 (G-C), CD95 (+A) và HbE – CD26 (AAG – GAG).
9 đột biến này được chia thành 3 bước sàng lọc đồng thời.
Bước 1: Sàng lọc 4 đột biến CD41/42 (-TCTT), CD17 (AAG – TAG), IVS 1-1 (G-T) và -28 (A – G)
Bước 2: Sàng lọc 4 đột biến IVS 2- 654 (C – T), CD71/72 (+A), IVS 1-5 (G - C) và CD 95 (+A).
Bước 3: Sàng lọc đột biến HbE (AAG – GAG) – CD26.
Các đột biến được phát hiện qua Multiplex ARMS –PCR, kiểu gen được xác định bằng ARMS –PCR. Đột biến CD26 của HbE được phát hiện trực tiếp bằng ARMS –PCR, nếu thấy có HbE trên điện di Hb.
- Điện di DNA trên gel agarose 1% với dòng điện một chiều, điện thế 100v, cường độ dòng điện 60 – 80 mA, quan sát sự di chuyển của vệt màu bromophenol blue có trong đệm tra mẫu để ngừng chụp với thời gian thích hợp.
Sau đó nhuộm DNA bằng EtBr (nồng độ 1µg/ml) trong thời gian 20 phút trên máy lắc nhẹ. Quan sát và chụp ảnh Gel, dưới ánh sáng cực tím UV ở bước sóng 320 nm, sản phẩm DNA sẽ quan sát thấy dạng các vết sáng
M ĐC (-) ĐC (+) BN (1) BN (2) H2O
BT ĐB BT ĐB BT ĐB BT ĐB BT ĐB
439bp
Hình 2.1. Sản phẩm DNA điện di trên gel agarose (mang 1 đột biến gen CD41/42) Được làm tại khoa di truyền phân
tử Bệnh viện nhi Trung ương
M: Marker 100bp H2O: Mẫu nước không chứa DNA
ĐC (-): Mẫu chứng không có đột biến BT: Bình thường
ĐC (+): Mẫu chứng có đột biến ĐB: Đột biến
BN: Mẫu bệnh nhân
- Kỹ thuật giải trình tự gen, xác định đột biến gen β-globin:
Kỹ thuật này được tiến hành với các mẫu không phát hiện được đột biến
gen bằng kỹ thuật Multiplex – PCR và ARMS – PCR ( hình 2.1.). Quy trình thực hiện gồm 3 phản ứng PCR khuếch đại trình tự đoạn gen β-globin 1 (exon 1,2, một phần intron 2), đoạn gen β-globin 2 (intron 2), đoạn gen β-globin 3 (một phần intron 2 và exon 3) có kích thước tương ứng và sử dụng các cặp mồi thích hợp.
Phân tích dữ liệu thu được, so sánh với trình tự nucleotide và axit amin tham khảo của ngân hàng Gene Bank.
- Kỹ thuật GAP PCR: Là kỹ thuật sử dụng một mồi xuôi, một mồi ngược gắn ở hai bên ranh giới của cùng DNA đứt gãy, mục đích để phát hiện đột biến mất đoạn toàn bộ gen β-globin.
- Quy trình phát hiện đột biến gen HBB được trình bày trong sơ đồ sau: Bệnh nhân β-thalassemia
Thu thập mẫu máu và tách DNA Phát hiện đột biến gen
bằng Multiplex PCR và ARMS PCR
Có đột biến gen
Xác định kiểu gen đột biến: Dị hợp tử, đồng hợp tử
Không thấy đột biến gen
Giải trình tự gen Hb
Có đột biến gen Phát hiện đột biến lớn
bằng GAP PCR
Sơ đồ 2.1. Sơ đồ quy trình phát hiện đột biến gen β-globin