7. Đ ÓNG GÓP MỚI CỦA ĐỀ TÀI
3.1.2. Kết quả phân tích đa dạng di truyền khoai môn sọ và một số loài gần sử
dụng chỉ thị phân tử ADN
3.1.2.1. Kết quả tách chiết ADN tổng số
ADN tổng số của các mẫu giống sau khi tách chiết được kiểm tra bằng đo quang phổ kế và điện di trên gel agarose:
- Kết quả đo quang phổ kế cho thấy các dung dịch ADN của các mẫu giống được kiểm tra có tỷ số OD260nm/OD280nm nằm trong khoảng 1,8 - 2.
- Điện di ADN tách chiết được trên gel agarose 0,8% (Hình 3.2) cho thấy các băng ADN thu được khá gọn, đồng đều
Hình 3.2. ADN tổng số tách chiết từ mô lá của các mẫu giống nghiên cứu
Kết quả đo OD và điện di ADN tách chiết chứng tỏ chất lượng ADN các mẫu giống nghiên cứu không bị đứt gẫy hay lẫn tạp, đảm bảo đủ sạch để sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo.
3.1.2.2. Kết quả phân tích đa hình PCR-RAPD a. Đa hình RAPD
Phản ứng PCR-RAPD với 28 mồi ngẫu nhiên thuộc các nhóm mồi OPN, OPM, UBC, OPO, OPC, S, BiO, OPA đã được nhân thành công. 14 mồi cho đa hình được sử dụng cho phân tích và ước lượng quan hệ di truyền. Các mồi còn lại cho các băng đơn hình hoặc đa hình không rõ ràng. Kích thước các băng ghi được từ 200 đến 4000 bp. Tổng số 5635 băng điện di được ghi nhận từ 14 mồi. Trong số 14 mồi phân tích, có 8 mồi cho thấy 100% đa hình (Bảng 3.2).
Như vậy, trong số 14 mồi phân tích, mồi BiO27 cho số kiểu băng ADN đa hình thấp nhất (13 băng), các mồi còn lại cho thông tin đa hình RAPD cao, số băng ADN trung bình/mồi là 28,4. Tỉ lệ phần trăm số băng ADN biểu hiện đa hình trong các mẫu giống nghiên cứu xê dịch trong khoảng 50% ở mồi OPC5 đến 100% ở các mồi UBC706, OPN3, OPN7, OPN12, OPO4, OPM6, OPM12 và BiO28. Tỉ lệ kiểu
băng đa hình trung bình/mồi là 96,23%. Nhiều mồi trong đó có thể dùng để nhận dạng các mẫu giống thuộc các chi, các loài và ngay cả các giống trong loài khoai môn sọ dựa trên các băng đặc trưng duy nhất và tổ hợp băng ADN đặc trưng được nhân bản (Bảng 3.3, Bảng 3.4).
Bảng 3.2. Tổng hợp kết quả điện di với 14 mồi RAPD
Số TT
Tên mồi Tổng số
băng ADN
Số kiểu băng ADN /mồi Số kiểu băng đơn hình Số kiểu băng đa hình
Tỉ lệ số kiểu băng đa hình (%) 1 UBC701 352 38 1 37 97,37 2 UBC706 493 31 0 31 100,00 3 UBC708 392 29 1 28 96,55 4 OPA18 346 35 1 34 97,14 5 OPN3 410 31 0 31 100,00 6 OPN4 483 22 3 19 86,36 7 OPN7 488 29 0 29 100,00 8 OPN12 319 26 0 26 100,00 9 OPC5 464 14 7 7 50,00 10 OPO4 540 38 0 38 100,00 11 OPM6 378 40 0 40 100,00 12 OPM12 319 27 0 27 100,00 13 BiO27 343 13 2 11 84,62 14 BiO28 308 25 0 25 100,00 Tổng cộng 5635 398 15 383 96,23
Kết quả phân tích đa hình RAPD trên là phù hợp với các kết quả đã công bố trong các công trình nghiên cứu của Irwin (1998) [52], Lakhanpaul (2003) [61], Shen (2000) [98], Sharma (2008) [96]…: Tỉ lệ mồi RAPD có ý nghĩa cho phân tích đa dạng di truyền loài khoai môn sọ và một số loài gần trong tổng số mồi sử dụng trong nghiên cứu đạt từ 50% đến 65,18% [52], [61]; Kích thước các băng điện di thu được từ phản ứng PCR từ 0,4 – 3,8 kb [49]; Mức độ đa hình cao quan sát được ở các mồi RAPD nghiên cứu, đạt trung bình từ 78,88% đến 97%/mồi [52], [61], [96], [98]; Chỉ thị RAPD (thông qua các băng nhân bản đặc trưng, duy nhất) hữu ích
cho nhận dạng phân tử các giống khoai môn sọ và các loài, chi có quan hệ gần gũi với khoai môn sọ [52], [84].
b. Phân tích mối quan hệ di truyền trong các loài nghiên cứu thuộc họ Ráy và đặc trưng phân tử của các mẫu giống nghiên cứu dựa trên chỉ thị RAPD
* Mối quan hệ di truyền trong các loài nghiên cứu thuộc họ Ráy dựa trên chỉ thị RAPD
Số liệu đa hình RAPD được sử dụng để phân nhóm quan hệ di truyền giũa các mẫu giống nghiên cứu sử dụng phần mềm NTSYSpc version 2.11x được minh họa trên hình 3.3.
Hệ số tương đồng di truyền của 51 mẫu giống nghiên cứu dao động trong khoảng từ 0,64 đến 0,96. Không có cặp mẫu giống nào có hệ số tương đồng di truyền đến 1,0. Sơ đồ hình cây nhận được từ phân tích UPGMA dựa trên hệ số tương đồng di truyền giữa 51 mẫu giống nghiên cứu (Hình 3.3) cho thấy: Ở mức tương đồng di truyền 75%, 51 mẫu giống nghiên cứu đã được phân trong 3 nhóm. Tất cả 40 mẫu giống khoai môn trồng (C. esculenta) và 1 mẫu giống Dọc mùng (C.
gigantea) hình thành nhóm lớn I, nhưng 2 loài môn hoang dại (C. lihengeae và C. menglaensis) lại được ghép trong nhóm III cùng các mẫu giống Ráy (Alocasia). Tất
cả các mẫu giống Khoai Mùng (Xanthosoma) được xếp trong cùng nhóm II với 2 nhóm phụ tương ứng với 2 loài: X. violacium có thân và thịt củ màu tím sẫm (Xa1 - Khoai Mán (Lạng Sơn)) và X. sagittifolium (bẹ lá và cuống lá xanh, thịt củ trắng hay tím nhạt) gồm các mẫu giống khoai mùng còn lại (Xa2 - Khoai Tam Đảo (Tuyên Quang), Xa3 – Khoai sọ đồi (Cao Bằng), Xa4 – Khoai sọ tím (Hòa Bình), Xa5 - Tam Đảo xanh (Sơn La) và Xa6 – Khoai sọ Mèo (Lai Châu)).
Nhóm I gồm tất cả các mẫu giống thuộc chi Colocasia, trong đó 40 mẫu giống khoai môn sọ thuộc loài C. esculenta xếp thành một nhóm phụ lớn, mẫu giống dọc mùng thuộc loài C. gigantea, hình thành một nhóm phụ nhỏ. Kết quả này
chỉ ra rằng C. gigantea mặc dầu hình thái lá, đặc biệt gân lá nổi rõ giống với lá của các loài Ráy (Alocasia) nhưng gần gũi với C. esculenta về mặt di truyền hơn là với các loài thuộc chi Xanthosoma và chi Alocasia. Kết luận tương tự cũng đã được báo cáo bởi Irwin và cs (1998) [52], Ochiai và cs (2001) [84] từ số liệu đa hình RAPD.
Hình 3.3. Quan hệ di truyền giữa loài khoai môn sọ và các loài gần dựa trên số liệu đa hình RAPD
C. esculenta và C. gigantea
Xanthosoma
Alocasia và 2 loài môn dại (C. lihengeae và
Nguyễn Văn Dư và Nguyễn Xuân Viết (2003) [4] báo cáo mẫu giống Cl – khoai môn tía hoang dại (C. lihengeae) là một loài khoai môn mới bổ sung vào danh lục các loài thuộc chi Colocasia trong hệ thực vật Việt Nam. Loài này mọc hoang dại, phân bố ở vườn Quốc gia Ba Vì và các tỉnh vùng núi và trung du Bắc Bộ, mang các đặc điểm đặc trưng của chi Colocasia (thân rễ, dải bò, hình dạng lá, cấu trúc hoa, kiểu đính noãn vách và có kiểu điện di isozym đặc trưng chi Colocasia) dù chúng có mang các đặc điểm thường thấy của chi Alocasia (phiến lá có gân giữa và các gân bên nổi rõ, gân con thường mờ, hai mặt lá thường bóng). Tuy nhiên, các tác giả cũng phán đoán rằng có thể đây là một loài lai tự nhiên. Kết quả phân tích RAPD và phân nhóm ở hình 3.3 cho thấy ADN của loài này là tương tự Alocasia
hơn so với Colocasia. Đây là kết quả không mong đợi, nhưng là bằng chứng phân tử có thể giúp giải quyết khó khăn trong việc xác định vị trí chủng loại phát sinh của loài khoai môn hoang dại này trong họ Ráy ở Việt Nam.
* Đặc trưng phân tử ở mức loài dựa trên chỉ thị RAPD
Đặc trưng phân tử các loài, chi được xác định nhờ các phân đoạn ADN khuếch đại đặc trưng duy nhất cho loài và chi (Bảng 3.3, Hình 3.4).
Bảng 3.3 cho thấy, 2 băng RAPD (vị trí băng 670 bp ở UBC706 và 625 bp ở
mồi OPN4) phân biệt khoai môn sọ với các loài và chi còn lại; 6 băng ADN (vị trí băng 650 bp ở mồi OPN4; 380 bp, 1340 bp và 1700 bp ở mồi OPM12; 380 bp ở mồi OPM6 và 430 bp ở mồi OPN3) chỉ có ở mẫu giống dọc mùng (C. gigantea); 9
băng ADN (các vị trí băng 380 bp và 1250 bp ở mồi UBC 706; 470 bp ở mồi
OPA18, 700 bp và 750 bp ở mồi OPN4; 500 bp ở OPN12; 1000 bp ở mồi UBC 701; 1450 bp ở mồi OPC5; 580 bp ở mồi BiO27) chỉ có ở các loài khoai mùng
(Xanthosoma); vị trí băng 240 bp ở mồi UBC701 chỉ có ở các loài ráy (Alocasia); 2 băng ADN (ở vị trí 280 bp ở mồi OPN3 và 1600 bp ở mồi BiO 28) chỉ có ở khoai môn hoang dại (C. lihengeae); 4 băng ADN (các vị trí 250 bp ở mồi UBC708, 1400 bp và 1500 bp ở mồi OPM12 và 1400 bp ở mồi OPA18) chỉ có ở loài khoai trắng lông hoang dại (C. menglaensis)… Các vị trí băng đặc trưng này có thể rất hữu ích trong việc nhận dạng các mẫu giống loài nghiên cứu.
Bảng 3.3. Đặc trưng phân tử có ý nghĩa nhận dạng loài khoai môn sọ và một số loài gần dựa trên chỉ thị RAPD
Số T T
Tên mồi Kích thước băng
(bp)
Đặc trưng phân tử có ý nghĩa nhận dạng loài, chi
Colocasia Xanthosoma Alocasia
C . e sc u le n ta C . g ig an te a C . l ih en ge ae C. m en gl ae n si s X a. v io la ci um X a. s ag itt if ol iu m A . o do ra A. m ac ro rr h iz a 1 UBC 706 280 + 380, 1250 + + 670 + + + + + + + 2 UBC 708 250430 + + 3 OPA18 470 + + 350, 780 + 1400 + 4 OPN4 625 + 650 + 700, 750 + + 5 OPN7 875 + 6 OPO4 250, 1170 + 280, 625 + 330 + 230 + 380, 670, 1340, 1700 + 1400 + 1500 + 300, 800 + 500 + + 9 OPM6 230, 650 + 380 + 780 + 280 + 430 + 450 + 500 + 240 + + 300, 380, 390 + 600 + 1000 + + 625 + 1450 + + 13 BiO27 580 + + 14 BiO 28 1600 +
Ce3 Ce6 Ce25 Ce31 Ce28 Ce12 Ce35 Ce11 Ce4 Xa1 Ce32 Ce24 Ce10 Ce7 Ce15 M Ce19 Ce26 Xa2 Ce5 Xa3 Ce2 Xa4 Xa5 Ce18 Xa6 Ce27 A1 Cm A2 Cl Cg M
M Ce16 Ce36 Ce21 Ce29 Ce22 Ce37 Ce17 Ce23 Ce13 Ce38 Ce39 Ce8 Ce14 Ce20 Ce3 Ce40 M Ce1 Ce9 Ce30 Ce33
2.000 bp 1.500 bp 1.000 bp 750 bp 500 bp 250 bp 2.000 bp 1.500 bp 1.000 bp 750 bp 500 bp 250 bp 470 bp 1400 bp 780 bp 350 bp 400 bp 1475 bp 1700 bp 1450 bp
Hình 3.4. Sản phẩm PCR với mồi OPA18 trên gel điện di và các vị trí băng đặc trưng loài, giống 300 bp 2.000 bp 1.500 bp 1.000 bp 750 bp 500 bp 250 bp
c. Đa dạng di truyền và đặc trưng phân tử các mẫu giống giống khoai môn sọ địa phương
* Đa dạng di truyền trong các mẫu giống khoai môn sọ địa phương
Phân tích đa hình RAPD từ 40 mẫu giống khoai môn sọ cho thấy: cặp mẫu giống Ce3 – Khoai sọ (Lạng Sơn) và Ce6 - Khoai Chũ (Bắc Giang) có mức sai khác di truyền nhỏ nhất (hệ số tương đồng di truyền 0,96). Đây cũng là cặp mẫu giống khoai môn sọ có nhiều đặc điểm giống nhau nhất trong các mẫu giống khoai môn sọ nghiên cứu từ đặc điểm hình thái đến các đặc điểm nông học. Không có cặp mẫu giống nào có hệ số tương đồng di truyền đến 1,0 phán đoán một sự đa dạng di truyền cao trong các mẫu giống nghiên cứu.
Với mức tương đồng di truyền 77%, 40 giống khoai môn sọ được phân trong 3 nhóm (I, II và III) (Hình 3.5)
Nhóm I gồm 17 mẫu giống, trong đó 16 mẫu khoai môn sọ tập trung thành một nhóm còn Ce33 - Khoai sọ trắng (Thanh Hóa) với các đặc điểm rất khác (bẹ và thân màu tím, có dải bò và củ có vị ngứa) ở một nhóm riêng biệt.
Ở mức tương đồng di truyền 79%, hai mươi mẫu giống trong nhóm II được hợp thành từ 3 nhóm. Nhóm phụ thứ 2 là tập hợp của nhiều các mẫu giống có chất lượng củ từ ngon đến ngon đặc biệt. Trong nhóm phụ thứ 2, ba mẫu giống: Ce3 - Khoai sọ (Bắc lệ - Lạng Sơn), Ce6 - Khoai Chũ - Bắc Giang) và Ce25 - Khoai sọ (Hải Dương) đều giống nhau về nhiều đặc điểm hình thái - nông học: thân có màu xanh, gần cuống lá tím nhạt tập hợp thành một nhóm phụ, trong đó cặp mẫu giống Ce3 và Ce6 là cặp mẫu giống có mức độ tương đồng di truyền lớn nhất (94%) trong số 51 mẫu nghiên cứu; 3 mẫu giống khoai Ce12 – Khoai Chợ Đồn (Bắc Kạn), Ce4 - Môn thơm (Lạng Sơn) và Ce11 - Khoai thơm (Thái Nguyên) cũng mang nhiều đặc điểm giống nhau, với mức tương đồng di truyền 92%, đều có bẹ lá xanh, gần cuống tím nhạt, rốn lá có chấm tròn tím đậm, ruột củ có sợi sơ tím nhạt, củ ăn có vị dẻo, bở và có mùi thơm đặc trưng. Mẫu giống Ce21 - Khoai sọ tím (Lai Châu) được xếp vào nhóm phụ thứ 3 riêng biệt trong nhóm II này.
Ba mẫu giống còn lại xếp vào nhóm III trong đó Ce19 - Cụ Cang (Sơn La) tách biệt riêng hẳn 2 mẫu giống Ce18 – Khoai sọ trắng (Hòa Bình) và Ce27 – Khoai sọ (Nam Định).
Hình 3.5. Quan hệ di truyền giữa 40 mẫu giống giống khoai môn sọ dựa trên số liệu đa hình RAPD
Nguồn gốc mẫu thu thập: - các tỉnh Đông Bắc - Bắc Bộ - các tỉnh Tây Bắc - Bắc Bộ
- Đồng bằng sông Hồng - các tỉnh Bắc Trung Bộ - Nam Trung Bộ và Nam Bộ
A: Kiểu củ:
- Eddoe type - Dasheen type
B: Vị ngứa: - Ngứa
C: Dải bò: - Có dải bò
D: Độ ngon của củ khi mấu chín: - Chất lượng kém - Chấp nhận được - Ngon - Rất ngon - Đặc biệt ngon A B I II III C D
Kết quả phân nhóm 40 mẫu giống khoai môn sọ dựa trên số liệu đa hình RAPD (Hình 3.5) cho thấy:
(1) Những giống khoai môn sọ có hình dạng củ kiểu khoai sọ và chất lượng củ trung bình (có đến 14/17 mẫu giống có củ kiểu khoai sọ, 12/17 mẫu giống có chất lượng củ trung bình) được xếp trong cùng nhóm (nhóm I) cũng được phát hiện trong nhóm I dựa trên đặc điểm hình thái – nông học. Hầu hết các mẫu giống được phân trong nhóm phụ II.2 là những mẫu giống có chất lượng củ cao. Các mẫu giống này cũng được phát hiện trong nhóm II, IV và nhóm V dựa trên đặc điểm hình thái - nông học.
(2) Một số giống khoai môn sọ có đặc điểm hình thái giống nhau biểu hiện sự tương đồng di truyền RAPD cao. Ví dụ các nhóm mẫu giống: Ce4, Ce11 và Ce12 có mức tương đồng di truyền 92%; Ce3 và Ce6, với mức tương đồng di truyền 96%.
* Đặc trưng phân tử các giống khoai môn sọ quý địa phương
Kết quả điện di sản phẩm PCR-RAPD cho thấy nhiều băng ADN duy nhất đặc trưng ở một số giống khoai môn sọ (Bảng 3.4). Các băng ADN này có thể có ý nghĩa nhận dạng giống, đặc biệt ở những giống có hình thái tương tự nhau.
Bảng 3.4 cho thấy, có đến 30 kiểu băng (các vị trí băng 850 bp ở mồi UBC
706 chỉ xuất hiện ở giống Ce15 – khoai sọ đồi (Yên Bái); 430 bp ở mồi OPN7 chỉ xuất hiện ở giống Ce32 – Sáp vàng (Thanh Hóa) ...) đặc trưng đối với một số mẫu
Bảng 3.4. Đặc trưng phân tử một số mẫu giống khoai môn sọ địa phương dựa trên chỉ thị RAPD
Số TT
Tên mồi Kích thước
Băng (bp)
Đặc trưng phân tử có ý nghĩa nhận dạng giống
1 UBC706 330 Ce14 – Hậu Rão (Tuyên Quang)
850 Ce15 – Khoai sọ đồi (Yên Bái) 580 và 750 Ce33 – Khoai sọ trắng (Thanh Hóa) 420 Ce32 – Sáp vàng (Thanh Hóa)
3 OPA18
300 Ce17 – Khoai sọ tím (Lai Châu) 400 Ce31 – Sọ trắng (Thanh Hóa) 1450 Ce33 – Khoai sọ trắng (Thanh Hóa) 1475 Ce8 – Khoai tím thơm (Bắc Giang) 1700 Ce40 – Khoai sọ (Tây Ninh) 240 và 380 Ce32 – Sáp vàng (Thanh Hóa) 430 Ce18 – Khoai sọ trắng (Hòa Bình)
5 OPN7
400 Ce13 – Hậu Đành (Tuyên Quang) 430 Ce32 – Sáp vàng (Thanh Hóa) 2100 Ce1 – Khoai sọ (Hà Giang)
7 OPM12 495 Ce20 – Mắc Phước (Điện Biên)
500 và 1100 Ce19 – Cụ Cang (Sơn La)
8 OPN12 280 Ce14 – Hậu Rão (Tuyên Quang)
9 OPM6 530 Ce4 – Môn thơm (Lạng Sơn)
1150 Ce9 – Khoai mán (Bắc Giang) 10 OPN3 250 và 400 Ce15 – Khoai sọ đồi (Yên Bái)
1475 Ce19 – Cụ Cang (Sơn La)
11 UBC701 250 và 460 Ce19 – Cụ Cang (Sơn La)
14 BiO28 300 Ce5 – Khoai sọ nương (Quảng Ninh)
875 và 1400 Ce15 – Khoai sọ đồi (Yên Bái)
d. Đa dạng di truyền và đặc trưng phân tử các giống khoai môn sọ (C. esculenta) theo vùng sinh thái
Để đánh giá sự đa dạng di truyền các mẫu khoai môn sọ theo vùng sinh thái, tổng số băng ADN và số các băng ADN đặc trưng vùng được thống kê cho mỗi vùng sinh thái (Bảng 3.5, Hình 3.6).
Bảng 3.5. Tổng số băng ADN và số băng ADN đặc trưng vùng được nhân lên