7. Đ ÓNG GÓP MỚI CỦA ĐỀ TÀI
2.3.4.Phương pháp nuôi cây mô, tế bào thực vật
2.3.4.1. Phương pháp nhân giống khoai môn sọ in vitro từ nuôi cấy đỉnh chồi
Nuôi cây mô, tế bào thực vật các giống khoai môn sọ nghiên cứu được thực hiện theo phương pháp tái sinh trực tiếp từ chồi đỉnh theo phương pháp của Chand (1999) [38] và Taylor (1999) [104].
Chọn những cây sinh trưởng và phát triển tốt, không bị sâu bệnh, cắt lấy phần chồi đỉnh hoặc chồi mắt có phần củ (khoảng 1cm). Mẫu được khử trùng 2 lần trong HgCl2 0,1% (khử trùng kép), sau đó cắt thành những mảnh nhỏ (1cm x 1cm x 0,2cm) cấy trên môi trường MS (Murashige và Skoog, 1962) để tạo vật liệu khởi đầu in vitro. Mẫu giống không bị nhiễm sau một tuần trên môi trường MS được cấy chuyển vào môi trường tái sinh thích hợp để tạo chồi. Việc tạo chồi và nhân nhanh chồi được tiến hành trên các môi trường MS có bổ sung các phytohormon ở các nồng độ khác nhau để xác định môi trường tối ưu. Chồi in vitro sinh trưởng, phát triển tốt, không bị sâu bệnh, có từ 3 - 5 lá, cao 5 - 7cm được tách từ môi trường nhân chuyển sang môi trường ra rễ. Sau giai đoạn ra rễ, các chồi có bộ rễ phát triển được đưa ra trồng trên các giá thể khác nhau trong điều kiện nhà lưới trong thời gian 2 tuần. Cây ươm sau đó được trồng ra ruộng để theo dõi và đánh giá khả năng sinh trưởng của cây giống in vitro giai đoạn ngoài đồng ruộng thí nghiệm. Chế độ chăm sóc, phân bón cho cây trồng ngoài đồng ruộng được thực hiện theo mô tả ở mục 2.3.1. Theo dõi sinh trưởng, phát triển của cây và năng suất, chất lượng củ thu hoạch theo các chỉ tiêu về hình thái và nông học: chiều cao cây, tỉ lệ đẻ nhánh, trọng lượng củ/khóm, mùi vị, độ dẻo… của củ khi nấu chín.
2.3.4.2. Phương pháp tạo củ in vitro và nhân giống từ củ in vitro
Cảm ứng tạo củ khoai môn sọ in vitro được thực hiện theo phương pháp của Zhou và cs (1999) [115].
Chồi in vitro nuôi cấy trên môi trường cơ bản MS có bổ sung 3% saccharose, 7 – 8 g agar/l, 0,1mg/l NAA và 2mg/l BAP đạt chiều cao 3 - 5 mm được cấy chuyển vào môi trường tạo rễ. Các chồi sau đó được cắt bỏ rễ và cấy chuyển vào môi trường MS. Sau khoảng 4 tuần tiếp tục cấy chuyển sang môi trường MS có bổ sung đường và chất kích thích sinh trưởng ở các nồng độ khác nhau để nghiên cứu sự cảm ứng hình thành củ của chồi cấy.
Mỗi bình tam giác 250 ml được cấy 4 - 5 chồi, 10 bình cây cho mỗi công thức thí nghiệm ở mỗi giống. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần cho mỗi công thức thí nghiệm. Các bình cấy được nuôi trong phòng vô trùng ở nhiệt độ 25 - 270C với 16 giờ chiếu sáng.
Củ hình thành được thu hoạch sau 4, 6, 8 tuần nuôi cấy trong môi trường cảm ứng tạo củ và được phân thành nhóm theo khối lượng củ tươi, số lượng củ được hình thành trong một cum chồi củ (tỉ lệ nhân củ).
Các củ có khối lượng tươi trên 0,2 g được bảo quản trong tủ lạnh ở điều kiện nhiệt độ 4 - 10oC trong thời gian 3 – 6 tháng. Củ in vitro được trồng ở vụ xuân trong nhà lưới có mái che, sau 2 tuần được đưa ra trồng ngoài đồng ruộng.