7. Đ ÓNG GÓP MỚI CỦA ĐỀ TÀI
1.2.3.Phân tích đa dạng di truyền khoai môn sọ
Trong phân tích đa dạng di truyền thực vật nói chung và khoai môn sọ nói riêng, người ta có thể sử dụng nhiều phương pháp khác nhau, từ phân tích các đặc điểm hình thái, nông học, sinh lí và hóa sinh đến các đặc điểm của phân tử ADN.
1.2.3.1. Phân tích đa dạng di truyền khoai môn sọ sử dụng chỉ thị hình thái
Trong nghiên cứu, các đặc điểm hình thái được sử dụng như một chỉ thị để phân tích đa dạng di truyền thực vật khi các tính trạng hình thái được kiểm soát bởi một locus gen đơn. Mặc dù, chỉ thị hình thái được sử dụng như một chỉ thị di truyền, song khả năng ứng dụng của nó trong chọn giống còn gặp phải hạn chế bởi các đặc điểm hình thái, nông học phần lớn do nhiều gen xác định, chịu ảnh hưởng của các nhân tố môi trường.
Trên đối tượng khoai môn sọ, nhiều nghiên cứu khoa học trong nước và quốc tế đã sử dụng chỉ thị hình thái để đánh giá đa dạng di truyền. Ở Việt Nam, trong số 478 giống đang lưu giữ tại Trung tâm Tài nguyên Thực vật – Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam, 201 mẫu giống đã được nghiên cứu đánh giá đa dạng di truyền sử dụng chỉ thị hình thái hoặc kết hợp chỉ thị hình thái và chỉ thị hóa sinh, tế bào (Nguyễn Thị Ngọc Huệ và cs (2000, 2003, 2004) [12], [13], [14]; Nguyễn Xuân Viết và cs (2002, 2006, 2007) [28], [29], [30]). Trên thế giới, chỉ thị hình thái được sử dụng kết hợp với chỉ thị sinh hóa và các chỉ thị khác đã thành công trong việc đánh giá đa dạng di truyền, phân loại khoai môn sọ trồng [47], [63] và đặc biệt trong xây dựng bộ sưu tập hạt nhân khoai môn sọ địa phương, quốc gia và khu vực cho mục đích bảo tồn và sử dụng hiệu quả nguồn gen [65], [85], [99].
1.2.3.2 Phân tích đa dạng di truyền khoai môn sọ sử dụng chỉ thị hóa sinh học
Các chỉ thị hóa sinh đa hình như isozyme và các protein dự trữ được phân tích bằng kỹ thuật điện di trên gel agarose hoặc gel polyacrylamid để phát hiện các biến dị khác nhau của phân tử enzyme. Các biến dị này có thể cung cấp thông tin như một loại chỉ thị đồng trội. Các phương pháp phân tích isozyme tiết kiệm về mặt kinh tế và kỹ thuật đơn giản hơn phương pháp phân tích ADN. Tuy nhiên, isozyme là sản phẩm của gen, số lượng của chúng có hạn và chúng chỉ thể hiện ở những giai đoạn nhất định trong quá trình phát triển cá thể. Vì vậy, loại chỉ thị này chỉ phản ánh chính xác một phần bản chất di truyền.
Ở loài khoai môn sọ (C. esculenta), bằng phương pháp điện di isozyme, Hirai và cs (1989) đã phát hiện các biến dị đối với hệ isozyme esterase và peroxidase trong các giống khoai sọ Nhật Bản và đã kết luận rằng có thể sử dụng biến dị điện di của 2 hệ enzym này để phân loại các giống khoai môn sọ [44]. Lebot và cs (1992) khi nghiên cứu biến dị điện di đối với 7 hệ enzyme (MDH, IDH, PGI, 6-PGD, ME, SKDH và ADH) trong 1417 giống khoai môn trồng và mọc dại ở châu Á và Thái Bình Dương, đã phát hiện được 143 kiểu hình isozyme, kết quả này cho thấy biến dị isozyme đối với các giống khoai môn sọ ở hai vùng này là rất cao. Đồng thời cũng cho rằng không có mối tương quan nào giữa kiểu hình điện di isozyme và kiểu hình thái hay mức bội nhiễm sắc thể [63]. Nguyen và cs (1998) đã sử dụng đa hình enzyme esterase để phân tích mối quan hệ phát sinh trong 69 mẫu giống khoai môn sọ (C. esculenta), và 15 mẫu giống thuộc một số loài có quan hệ gần gũi với khoai môn sọ (C. gigantea, Xanthosoma sagittifolium, Xanthosoma
violaceum, Alocasia odora và Alocasia macrozzhiza) [80]. Kết quả phân tích cho
thấy, dọc mùng (C. gigantea) có quan hệ gần với các loài ráy hơn với khoai môn sọ và vùng Yunnan có thể là vùng quan trọng trong sự mở rộng tiến hóa ở loài khoai môn sọ. Phân tích di truyền các biến dị isozyme của 13 hệ enzyme (ADH, EST, LAP, PGM, ACP, DIA, GQT, HEX, IDH, PGD, PGI, SKDH và SOD của Nguyen và cs (1998, 1999) [79], [81], các tác giả đã phát hiện 21 locus gen chi phối và cung cấp nhiều chỉ thị di truyền có ý nghĩa trong nghiên cứu đa dạng di truyền và chọn
giống ở loài khoai môn sọ. Lebot và cs (2010) [66] đã đánh giá đa dạng di truyền khoai môn sọ ở Châu Á – Thái Bình Dương dựa trên các dữ liệu phân tích isozyme và các đặc điểm hình thái - nông học. Tổng số 2.298 mẫu giống khoai môn sọ thu thập ở các nước Việt Nam, Thái Lan, Malaysia, Indonesia, Philippines, Papua New Guinea và Vanuatu đã được miêu tả dựa trên 23 đặc điểm hình thái. 2081 mẫu giống được lựa chọn phân tích isozyme sử dụng 6 hệ enzyme (MDH, PGI, ICD, PGD, ME và SKDH). Kết quả nghiên cứu đã chỉ ra rằng, sự đa dạng hình thái là khá cao trong vùng, mức độ đa dạng di truyền khác nhau rất nhiều giữa các nước, các vùng. Nguyên nhân của sự khác biệt này bắt nguồn từ sự khác biệt di truyền giữa các quần thể khoai môn hoang dại do sự cô lập về mặt địa lý giữa Đông Nam Á và Melanesia. Hai vốn gen khoai môn sọ khác biệt đại diện cho kết quả của hai quá trình thuần hóa khác nhau. Ở Melanesia, khoai môn sọ là mùa vụ chính và các giống khoai môn sọ đã được cải tiến nhằm thỏa mãn nhu cầu đa dạng của người sử dụng. Hầu hết các giống khoai môn sọ trồng ở vùng này được chọn lọc trong môi trường không có các tác nhân gây bệnh. Còn các giống khoai môn sọ ở châu Á ít được cải tiến hơn, nhưng các dòng gen thường xuyên được trao đổi. Ở vùng này, hầu hết các giống khoai môn sọ trồng đã cùng tiến hóa với nguồn gây bệnh nguy hại nhất của chúng: Phytophthora colocasiae. Có lẽ đó cũng là nguyên nhân lí giải cho khả năng kháng bệnh bạc lá thấp của các giống khoai môn sọ ở Melanesia và các nước thuộc quần đảo Thái Bình Dương [66]. Phân tích đa dạng di truyền 677 mẫu giống khoai môn sọ thu thập ở 7 vùng khác nhau của Indonesia sử dụng 6 hệ enzyme (MDH, PGI, ME, PGD, IDH VÀ SH), Prana và cs (2010) [89] đã chỉ ra rằng các kiểu hình điện di enzyme khác nhau được tìm thấy ở các cây khoai môn sọ trồng thuộc các vùng sinh thái khác nhau. Điều đáng ngạc nhiên là có đến 17,43% kiểu enzyme xuất hiện trong bộ sưu tập chỉ phát hiện ở một mẫu giống. Trên quan điểm bảo tồn, kết quả này chỉ ra sự mong manh việc lưu giữ vì mẫu giống quan tâm có thể mất đi bất cứ khi nào. Sự đa dạng di truyền cao quan sát thấy ở các mẫu giống có nguồn gốc từ 3 vùng: Tây Java, Nam Sulawesi và Lampung của Nam Sumatra. Nghiên cứu cũng cho thấy, không có mối tương quan giữa kiểu hình điện
di enzyme và kiểu hình thái. Phát hiện này cũng được Lebot và cs (1992) đưa ra khi nghiên cứu đa dạng di truyền khoai môn sọ ở châu Á – Thái Bình Dương [63]. Manzano và cs (2010) [72] nghiên cứu sự đa dạng hình thái – hóa sinh của 42 giống khoai thu thập ở Cuba dựa trên phân tích các đặc điểm hình thái và phân tích enzyme peroxydase và esterase trong dịch chiết mô lá của khoai môn sọ. 28 đặc điểm hình thái – nông học (gồm 12 đặc điểm của củ và 16 đặc điểm của lá) đã được sử dụng là những đặc điểm quan trọng nhất cho đánh giá hình thái – nông học các giống khoai này. Trong đó, 13 đặc điểm được đề xuất là có thể sử dụng cho việc xây dựng bộ sưu tập hạt nhân ở Cuba. Tổng số 27 alen đa hình được phát hiện ở 12 locus của 2 hệ ezyme peroxydase và esterase, phát hiện 20 alen trong đó là alen hiếm (ở hệ enzyme esterase). Số alen trung bình/locus là 2,25. Từ kết quả phân tích hình thái và enzyme, tác giả đã cho rằng, sự tiến hóa của khoai môn sọ ở Cuba có nguồn gốc từ khoai môn sọ ở châu Phi và Nhật Bản cũng như từ Trung tâm của nguồn gốc khoai môn sọ ở Ấn Độ và Philippines [72]. Nghiên cứu đa dạng di truyền khoai môn sọ ở Yunnan, Trung Quốc dựa trên các phân tích về thực vật học dân tộc, đa hình isozyme và RAPD, Xixiang và cs (2010) [109] đã phát hiện thấy mức độ khác nhau về đa dạng di truyền của các giống khoai môn sọ ở các địa phương và các dân tộc.
Ở Việt Nam, Nguyễn Xuân Viết đã có nhiều nghiên cứu phân tích đa hình điện di isozyme để đánh giá đa dạng di truyền khoai môn sọ, mối liên quan giữa đa dạng di truyền khoai môn sọ và vùng địa lý sinh thái; kết hợp giữa phân tích isozyme và đặc điểm hình thái để phân loại khoai môn sọ, các loài gần với khoai môn sọ; xác định sự tiến hóa trong chi Colocasia, phát hiện loài lai trong tự nhiên… [4], [26], [29], [30]. Nguyễn Thị Ngọc Huệ và cs (2004) đã sử dụng kỹ thuật điện di trên 6 hệ enzyme: MDH, PGI, ICD, PGD, ME và SKDH với dịch chiết từ lá của cây môn sọ để khảo sát sự biến động di truyền của tập đoàn môn sọ. Kết quả tập hợp nhóm trên cơ sở của biến động enzyme cho thấy trong tập đoàn 201 mẫu giống tồn tại 74 zymotypes. Trong số đó có 39 zymotypes đặc trưng chỉ có ở Việt Nam. Biểu đồ minh họa chỉ số tương đồng của các mẫu giống khoai sọ cho thấy Việt nam có 2
kiểu nhóm gen khoai môn sọ rõ rệt. Một nhóm mang các kiểu gen của miền núi phía Bắc tương tự như các giống của Vân Nam Trung Quốc. Nhóm kia bao gồm các kiểu gen đặc trưng của vùng Đông Nam Á. Nghiên cứu sự phân bố của các zymotypes tại các vùng sinh thái của Việt Nam cho thấy các tỉnh ở miền núi phía Bắc có sự đa dạng di truyền cao hơn các vùng khác. Nghiên cứu đa dạng di truyền tập đoàn môn sọ theo vùng địa lý cũng đã được nghiên cứu. Kết quả đánh giá dựa vào giá trị chỉ số đa dạng Shanon - Weaver (H’) cho thấy có sự biến động khá rõ nét tại các vùng sinh thái về các đặc điểm hình thái nông học. Kết quả đánh giá dựa trên kết quả giá trị chỉ số Shanon - Weaver cũng trùng với kết quả phân tích thống kê NTSYS và phân tích isozyme cho phép kết luận Vùng Đông Bắc, Bắc Trung Bộ và Tây Bắc là 3 vùng có sự đa dạng nhất nguồn gen môn sọ (C. esculenta) ở Việt Nam. Các vùng này có thể chọn để xây dựng các điểm bảo tồn tại chỗ cho nguồn gen môn sọ ở nước ta. Vùng có nhiều nguồn gen quí như Đông Bắc và Trung du có thể xây dựng thành vùng sản xuất hàng hoá để phát triển nông nghiệp và nông thôn bền vững, góp phần xoá đói giảm nghèo và đảm bảo an ninh lương thực cho đồng bào vùng cao [14].
1.2.3.3. Phân tích đa dạng di truyền khoai môn sọ sử dụng chỉ thị phân tử ADN * Một số chỉ thị ADN thường được sử dụng trong nghiên cứu đa dạng di truyền thực vật
Chỉ thị phân tử ADN gồm nhiều loại khác nhau. Trong thời gian đầu chủ yếu là RFLP, dựa trên cơ sở mẫu giống dò đặc hiệu. Sau khi phát minh ra PCR, người ta đã phát triển tiếp các chỉ thị dựa trên phương pháp này như RAPD, AFLP, SSR …
Kỹ thuật RFLP là kỹ thuật sử dụng các endonuclease giới hạn cắt ADN hệ gen ở trình tự nhận biết đặc trưng tạo ra hàng loạt đoạn ADN có độ dài xác định, số lượng các đoạn này phụ thuộc vào số điểm nhận biết trong hệ gen. Đa hình độ dài này được phát hiện sử dụng các mẫu giống dò ADN (probe). RFLP là chỉ thị đồng trội, có độ tin cậy cao, được sử dụng nhiều trong phân tích liên kết và chọn giống thực vật, phát hiện tính biến dị của ADN trong các giai đoạn phát triển, mối quan hệ di truyền, nghiên cứu quan hệ họ hàng. Tuy vậy, RFLP đòi hỏi kỹ thuật phức tạp, tốn kém, mất thời gian và cần một lượng ADN lớn (50 – 200 ng từ mỗi cá thể) [24].
Kỹ thuật RAPD phân tích sự đa hình các phân đoạn ADN được nhân bản ngẫu nhiên, do hai nhóm Williams và CS phát minh năm 1990, Welsh và Mc Clelland hoàn thiện năm 1991. Kỹ thuật này được phát hiện dựa trên phản ứng chuỗi polymerase (PCR) sử dụng mồi ngẫu nhiên nhằm nhân các đoạn ADN đặc trưng. Kỹ thuật RAPD có ưu điểm ở chỗ sử dụng các mồi ngẫu nhiên ngắn, quá trình nhân bản ADN là ngẫu nhiên nên xác suất đoạn mồi có được điểm gắn trên phân tử ADN khuôn là rất lớn. Trong những năm gần đây, kỹ thuật RAPD được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu đa dạng di truyền, xác định tính đa dạng sinh học và quan hệ họ hàng của các giống thực vật, động vật khác nhau trong các loài [24], [52], [61]… Hạn chế chủ yếu của kỹ thuật RAPD là độ đặc hiệu không cao, kết quả phân tích không ổn định. Do đó, phân tích di truyền để đảm bảo kết quả có độ chính xác cao, cần sử dụng kết hợp kỹ thuật RAPD với các kỹ thuật khác [24], [93], [99].
Kỹ thuật AFLP là kỹ thuật kết hợp của RFLP và PCR. AFLP phát hiện một cách có chọn lọc các đoạn ADN hệ gen được cắt bởi enzyme giới hạn và gắn với đoạn tiếp hợp (adaptor). AFLP hoạt động dựa trên nguyên tắc tương tự như RAPD, tuy nhiên có điểm khác biệt là mồi bao gồm hai phần: phần cố định dài khoảng 15 bp chứa điểm nhận biết của enzyme giới hạn, phần thay đổi dài khoảng 2 - 4 bp. AFLP rất có hiệu quả trong xác định quan hệ di truyền và lập bản đồ. Hiện nay, phân tích AFLP sử dụng phương pháp nhuộm bạc nên dễ áp dụng, tuy giá thành có cao hơn so với phương pháp RAPD và việc thiết kế mồi phức tạp nhưng AFLP có ưu điểm là thời gian cho kết quả nhanh, đòi hỏi lượng ADN ít, cho đa hình cao [24]. Kỹ thuật SSR được Litt và Luty phát triển năm 1989 dựa trên nguyên lý của PCR. Trong cấu trúc hệ gen của sinh vật nhân thực tồn tại nhiều trình tự 2 - 6 nucleotide lặp lại nhiều lần. Các trình tự lặp mang tính đặc trưng loài và phân bố rải rác trong hệ gen của thực vật bậc cao. Đoạn mồi được thiết kế dựa trên vùng bảo thủ ở hai đầu của đoạn SSR. Do đó các phân đoạn ADN được nhân sẽ có độ dài ngắn khác nhau (đa hình độ dài SSR). Các trình tự lặp lại thường tập trung ở vùng dị nhiễm sắc trên nhiễm sắc thể, có vai trò điều hòa hoạt động của các gen, góp phần làm tăng tính ổn định cơ học của nhiễm sắc thể trong phân bào. SSR là công
cụ hữu ích trong phân tích hệ gen và chọn giống cây trồng vì đây là chỉ thị đồng trội có khả năng phát hiện tính đa hình rất cao. Trong thực tế chỉ thị này đã được sử dụng nghiên cứu một số tính trạng liên quan đến năng suất, xác định giới tính, phân tích quan hệ di truyền, lập bản đồ gen…[24], [45]. Tuy vậy, sự phức tạp trong thiết kế mồi đặc hiệu cho mỗi locus do phải tách dòng và đọc trình tự một số lượng lớn các đoạn ADN bộ gen chứa SSR đã hạn chế số lượng các mồi được phát triển đối với nhiều loài.
* Ứng dụng chỉ thị phân tử ADN trong các nghiên cứu trên khoai môn sọ
Đã có nhiều báo cáo nghiên cứu đa dạng di truyền nguồn gen khoai môn sọ sử dụng các chỉ thị phân tử ADN khác nhau như RAPD [52], [61], [73], [84], [96], [98], [101]; AFLP [37], [65], [90]; SSR [48], [70], [71], [82], [93], [99].
Chỉ thị RAPD được Irwin và cs sử dụng đầu tiên trên đối tượng khoai môn sọ vào năm 1998 (Irwin, 1998). Sau đó là các nghiên cứu của Ochiai và cs (2001), Lakhanpaul và cs (2003)… Các nghiên cứu đã cho thấy sự đa dạng di truyền cao của khoai môn sọ ở các vùng nghiên cứu [52], [61], [73], [96], [98], [101], [84]. Chỉ thị RAPD không chỉ hữu ích trong nghiên cứu đa dạng trong loài khoai môn sọ mà còn là một chỉ thị hữu ích cho phân biệt các dạng khoai môn sọ lưỡng bội và tam bội từ các kiểu băng điện di nhân bản đặc trưng [52], [73], [84]; nhận dạng các giống khoai môn sọ nhờ các băng ADN đặc trưng được nhân lên từ các mẫu giống [52], [84], [96], [101]; nhận dạng phân tử các loài có quan hệ gần với khoai môn sọ như các loài khoai mùng (Xanthosoma) và loài dọc mùng (C. gigantea) [52] hay