7. Đ ÓNG GÓP MỚI CỦA ĐỀ TÀI
2.3.5.Phương pháp chọn dòng đột biến
2.3.5.1. Phương pháp xử lí chiếu xạ, đánh giá và chọn lọc dòng đột biến in vitro
Xử lí chiếu xạ tia gamma (nguồn Co60) lên chồi khoai môn sọ in vitro được thực hiện theo phương pháp của Seetohul và cs (2007) [94].
* Vật liệu chiếu xạ: Các chồi in vitro khỏe, cao 0,5 - 1cm, có từ 2 - 3 lá/chồi
được dùng để xử lí chiếu xạ tia gamma (nguồn Co60) (liều 50 rad/s). * Bố trí thí nghiệm:
Sáu công thức thí nghiệm được thiết kế với các liều chiếu khác nhau, công thức đối chứng (Đ/C) không chiếu xạ:
Công thức 2 (CT2): 20 Gy Công thức 3 (CT3): 30 Gy Công thức 4 (CT4): 50 Gy Công thức 5 (CT5): 70 Gy Công thức 6 (CT6): 90 Gy
Mỗi công thức chiếu xạ bố trí 50 cây in vitro, được lặp lại 2 lần một cách độc lập.
* Các chồi in vitro sau khi xử lý đột biến được đưa trở lại phòng nuôi cấy trong khoảng 1 tuần, sau đó được nhân liên tiếp qua 4 lần.
* Phương pháp đánh giá ảnh hưởng của tia gamma (nguồn Co60):
- Ảnh hưởng của liều lượng chiếu tia gamma đến tỉ lệ sống sót của các chồi ở thời điểm 1, 2, 3, 4 tuần sau xử lí chiếu xạ.
- Phương pháp xác định liều chiếu xạ gây chết 50% (LD50) số chồi in vitro sau chiếu xạ 4 tuần được tính theo phương pháp giao diện đồ họa (graphical method) dựa vào sự quan sát tỉ lệ phần trăm chồi sống sót sau chiếu xạ theo Sharma (1998) [95].
- Khả năng nhân lên của chồi xử lý chiếu xạ được đánh giá trong điều kiện in vitro tại thời điểm 4 tuần sau cấy của mỗi lần cấy chuyển.
- Tỷ lệ ra rễ của chồi in vitro ở các công thức chiếu tia gamma:
- Ảnh hưởng của liều chiếu xạ đến sự xuất hiện các biến dị về các đặc điểm hình thái được theo dõi và tính tần số biến dị:
Số chồi chiếu xạ Số chồi sống
Tỷ lệ sống sót (%) = X 100 %
Số chồi cấy ban đầu
Số chồi thu được sau 4 tuần nuôi cấy
Hệ số nhân (lần) =
Số chồi thí nghiệm Số chồi ra rễ
2.3.5.2. Phương pháp theo dõi, đánh giá và chọn lọc các dòng đột biến qua các thế hệ trên đồng ruộng
- Cây in vitro được chiếu xạ (M0) còn sống sót cao 5 – 7 cm, được đưa ra ngoài vườn ươm. Sau 3 - 4 tuần huấn luyện ở vườn ươm, cây được đưa ra trồng ngoài đồng ruộng.
- Ngoài đồng ruộng, cây được trồng riêng rẽ để thu củ thế hệ thứ nhất – Thế hệ M1. Củ thu hoạch từ thế hệ M1, được đánh dấu và thu hoạch riêng để trồng ở vụ tiếp theo – thế hệ M2. Ở thế hệ M2, chọn ra 8 -14 củ/dòng ở các dòng mang biến dị tốt để trồng và theo dõi tiếp ở thế hệ M3. Các thế hệ và các dòng trồng ở mỗi thế hệ được áp dụng cùng kỹ thuật chăm sóc như nhau.
- Theo dõi sự phát triển của các dòng chọn lọc qua các giai đoạn phát triển trong một vụ trồng. Đánh giá các chỉ tiêu nông sinh học của các dòng chọn lọc qua các thế hệ: hình dạng lá, chiều cao cây, khối lượng củ tươi, hệ số nhân chồi, thời gian sinh trưởng, khả năng chịu nắng.
2.3.5.3. Phương pháp đánh giá dòng đột biến
* Đánh giá sự sai khác của dòng đột biến so với giống gốc về một số đặc điểm hình thái cây, năng suất, chất lượng củ ... tiến hành theo như mô tả như ở mục 2.3.2.1. * Đánh giá sự sai khác về một số thành phần dinh dưỡng của dòng đột biến so với giống gốc: hàm lượng chất khô, hàm lượng protein thô, thành phần một số chất khoáng đa lượng, vi lượng tiến hành theo mô tả ở mục 2.3.3.
* Phân tích PCR – SSR để đánh giá sự sai khác di truyền của dòng đột biến so với giống gốc tiến hành theo mô tả ở mục 2.3.2.4.