khuẩn
Cơ chất sử dụng để khảo sát khả năng thủy phân của enzym là các nguyên liệu giàu cellulose (rơm). Nguyên liệu sau khi được xử lý, sấy khơ đem sử dụng để làm cơ chất cho quá trình thủy phân
2.4.4.1. Tiền xử lý nguyên liệu
Rơm được rửa sạch, cắt nhỏ và sấy khơ đến khối lượng khơng đổi, sau đĩ đem nghiền nhỏ trong vịng 10 phút bằng máy nghiền hạt và được sử dụng làm nguyên liệu cho quá trình tiền xử lý.
Rơm nguyên liệu được tiền xử lý bằng phương pháp kiềm theo Tsai và cộng sự. Trước tiên, cho rơm và dung dịch NaOH 10% với tỷ lệ 1:20 (w/v) gia nhiệt đến 90°C trong 1 giờ, sau đĩ đem lọc và rửa sạch cho đến khi pH trung tính, cuối cùng đem sấy khơ, lưu trữ trong các túi nilong và đem xác định các thành phần hĩa học trước khi sử dụng làm cơ chất của quá trình thủy phân bằng enzym [61].
2.4.4.2. Ảnh hưởng của một số yếu tố đến hiệu suất đường hĩa lignocellulose của rơm sử dụng cellulase từ Cellulosimicrobium cellulans MP1
Thí nghiệm thủy phân được thực hiện trong bình tam giác 250ml, thể tích làm việc là 100ml. Bổ sung nguyên liệu và enzym với các tỷ lệ, thời gian, nhiệt độ và pH như chỉ ra trong từng thí nghiệm. Mẫu đối chứng được làm tương tự mẫu thí nghiệm với enym đã được bất hoạt bằng cách đun sơi trong 15 phút. Kết thúc phản ứng xác định hàm lượng đường khử tạo thành bằng phương pháp DNS. HIệu suất đường hĩa được tính theo cơng thức:
Hiệu suất đường hĩa (%) = ×100 [60].
thủy phân ở các nhiệt độ khác nhau 40°C, 50°C, 60°C. Xác định hàm lượng đường khử và hiệu suất đường hĩa tương ứng. Nhiệt độ cho hiệu suất đường hĩa cao nhất là nhiệt độ được lựa chọn
Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất: nồng độ cơ chất trong dung dịch (g/ml) lần lượt là 1:100; 2:100; 3:100. Nồng độ enzym là 75U/g cơ chất, thời gian, nhiệt độ đã được lựa chọn ở các thí nghiệm trên, Xác định hàm lượng đường khử và hiệu suất đường hĩa tương ứng với nồng độ cơ chất.
Ảnh hưởng của nồng độ enzym: thay đổi nồng độ enzym lần lượt từ 7.5 U/g đến 75U/g. Các thơng số khác đã được lựa chọn ở trên. Xác định hàm lượng đường khử và hiệu suất đường hĩa tương ứng với nồng độ enzym để lựa chọn nồng độ enzym thích hợp
Ảnh hưởng của pH: thay đổi pH khác nhau từ pH 4,0 đến pH 7,0. Các yếu tố được lựa chọn ở trên, xác định hàm lượng đường khử và hiệu suất thủy phân tương ứng để lựa chọn giá trị pH phù hợp
2.4.5. Phân tích trình tự rRNA, sinh lý, sinh hĩa và 16S
Hình dáng và kích thước của chủng vi khuẩn được xác định bằng kính hiển vi điện tử quét (SEM) JSM-5410 (JEOL, Tokyo, Nhật Bản). Quá trình nhuộm Gram được thực hiện bằng phương pháp thơng thường và xác nhận bằng phép thử KOH[76].
Bộ gen DNA để giải trình tự 16S rRNA được chuẩn bị bằng phương pháp chiết bằng phenol-chloroform. Khuếch đại trình tự gen 16S rRNA của các chủng vi khuẩn được thực hiện bằng cách sử dụng cặp mồi đặc hiệu 27F/1492R
Với trình tự: 5r- TAACACATGCAAGTCGAACG-3r và 1492R: 5r-GGTGTGACGGGCGGTGTGTA-3r [77]
Chu trình PCR: mẫu PCR được tiến hành trong tổng thể tích 25 µl. Chương trình PCR được thực hiện ở 6 bước (bước 1: 94o
C, 2 phút; bước 2: 94oC, 1 phút; bước 3: 54 đến 57oC, 1 phút; bước 4: 72oC, 1 phút; bước 5: 72oC, 6 phút; bước 6: 4ơC, 60 phút; bước 2, 3 và 4 lặp lại 40 chu kỳ). Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng QIAquick Gel Extraction kit và giải trình tự trên máy đọc trình tự tự động ABIPRISM® 3100-Avant Genetic Analyzer tại viện cơng nghệ sinh học, Viện Hàn Lâm Khoa học và Cơng nghệ Việt Nam. Trình tự 16S rDNA so sánh với các trình tự tương ứng trên GenBank (NCBI) nhờ cơng cụ Blast (www.ncbi.nlm.nih.gov). So sánh độ tương đồng bằng phần mềm Clustal W [78].
Cây phát sinh lồi dựa trên trình tự gen 16S rDNA được xây dựng trên phần mềm MEGA 6 bằng cách sử dụng phương pháp Maximum –likelihood, dựa trên
phần trăm của 1000 mẫu bootstrap và Bifidobacterium bifidum DSM 20456 (S83624) và được sử dụng làm nhánh nhĩm ngồi.
Trình tự gen16S rDNA của chủng MP1 được gửi vào ngân hàng gen (NCBI) theo số gia nhập MW534740.
2.4.6. Giải trình tự hệ gen của chủng Cellulosimicrobium cellulans MP1 và dự đốn gen chức năng
2.4.6.1. Tách chiết DNA hệ gen của vi khuẩn
Để xây dựng thư viện, DNA được chiết từ khuẩn lạc lấy trên mơi trường nuơi cấy bằng cách sử dụng G-spinTM Total DNA Extraction mini Kit theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Số lượng và chất lượng của DNA được đánh giá bằng điện di trên gel agarose 0,6% (w/v) và máy quang phổ NanoDrop 2000 Thermo Scientific để xây dựng thư viện bộ gen. Thư viện bộ gen đã xây dựng sau đĩ được giải trình tự bằng cách sử dụng thiết bị Illumina (Illumina, California, Hoa Kỳ)
2.4.6.2 Giải trình tự DNA đa hệ gen bằng máy giải trình tự thế hệ mới HiSeq2000 của Illumina của Illumina
Giải trình tự DNA hệ gen được chia làm 3 giai đoạn: tạo thư viện NGS (Next Generation Sequencing), tạo nhĩm DNA và giải trình tự DNA bằng phương pháp tổng hợp [80].
- Tạo thư viện NGS: Mẫu DNA đa hệ gen được máy cắt DNA (Covaris S220) cắt ngẫu nhiên thành các đoạn DNA kích thước khoảng 100 bp. Sau đĩ, mỗi đoạn DNA được gắn với adapter (oligonucleotide) chuyên biệt ở cả 2 đầu. Các đoạn DNA cĩ kích thước thích hợp được lựa chọn và được phân lập. Sau bước làm sạch mẫu, thư viện DNA được định lượng bằng qPCR và kiểm tra chất lượng bằng máy phân tích sinh học Bioanalyzer. Cuối cùng, DNA-adapter được biến tính thành sợiđơn.
- Tạo nhĩm DNA: trình tự adapter của các phân tử DNA-adapter sợi đơn sẽ liên kết bổ sung với 2 loại trình tự tương ứng đã được gắn sẵn trên các rãnh bề mặt của 1 vi bản. Sau đĩ, chính trình tự đã được gắn trên bề mặt vi bản sẽ được dùng làm mồi để tổng hợp sợi DNA mới cĩ trình tự bổ sung với sợi DNA liên kết với nĩ tạo thành phân tử DNA sợi đơi. Phân tử DNA sợi đơi này sẽ được biến tính tạo
Quá trình khuếch đại và biến tính lại lặp đi lặp lại cho đến khi tạo thành hàng triệu nhĩm DNA sợi đơn. Trong mỗi nhĩm các sợi DNA cĩ trình tự giống hệt nhau.
- Giải trình tự bằng tổng hợp: các deoxynucleoside triphosphate (dNTP) được sử dụng để giải trình tự đều gắn với nhân tố kết thúc đảo ngược đã được đánh dấu huỳnh quang. Mỗi loại nucleotide được đánh dấu huỳnh quang màu sắc khác nhau. Chu kì giải trình tự bắt đầu khi dNTP thứ nhất được gắn bổ sung với khuơn DNA. dNTP này sẽ được tia lase quét để xác định đỉnh màu sắc huỳnh quang tạo ra, đồng thời dưới tác động của lase, nhân tố kết thúc đảo ngược của dNTP đĩ sẽ bị phân hủy. Lúc này, dNTP thứ hai mới cĩ thể tiếp tục gắn vào nucleotide thứ nhất và lại được xác định. Quá trình giải trình tự cứ lặp đi lặp lại như vậy cho đến khi sợi DNA bổ sung được tổng hợp xong. Trình tự nucleotide được xác định dựa trên các đỉnh màu sắc. Máy HiSeq 2000 giải trình tự đồng thời 10 triệu cụm DNA.
Kiểm sốt chất lượng và cắt bớt chỉ số được thực hiện bằng FastQC phiên bản 0.11.5 (http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc) và phiên bản Trimmomatic 0,36 [81].
2.4.6.3. Lắp ráp de novo hệ gen và đánh giá chất lượng lắp ráp
Tập hợp bộ gen de novo được thực hiện bằng SPAdes v.3.13 [82], sau đĩ được phân tích và hồn chỉnh bằng cách sử dụng điểm chuẩn đa phương tiện (BUSCO) phiên bản 3 (https://gitlab.com/ezlab/busco).
Chất lượng lắp ráp được đánh giá dựa trên các thơng số như: kích thước hệ gen, chỉ số N50 (chỉ số N50 là kích thước của các contig đã được sắp xếp theo độ dài từ lớn đến nhỏ tại vị trí kích thước đạt 50% bộ gen) và các trình tự đọc này được đánh giá chất lượng bằng phần mềm FastQC, được xử lý phần mềm Trimmomatic [81], với các thơng số SLIDINGWINDOW:8:20 để loại bỏ các trình tự cĩ chất lượng thấp hơn Q20 và CROP:215 để loại bỏ các base cĩ tín hiệu nhiễu từ sau vị trí 215. Quá trình lắp ráp được thực hiện bằng phần mềm VelvetOptimiser (Gladman và Seemann, 2012) để lắp ráp với giá trị từ k-mer cĩ kích thước bằng 36 bp (giá trị khởi đầu mặc định của phần mềm) đến k-mer cĩ kích thước bằng 211 bp (độ dài lớn nhất của trình tự đọc) và chọn ra bản lắp ráp cĩ tập contig tốt nhất với k-mer = 87.
2.4.6.4. Dự đốn gen và chú giải hệ gen
Những contig của hệ gen được thực hiện dự đốn bằng hai phần mềm là Prodigal (Hyatt và cs., 2010); GeneMarkS (Besemer và cs., 2001). Đối với Prodigal và GeneMarkS các thơng số được mặc định cho đối tượng vi khuẩn. Để chọn ra những gen để đảm bảo độ tin cậy, những gen cĩ trình tự tương đồng 100% giữa kết quả của cả 2 phần mềm được lọc để sử dụng cho các phân tích tiếp theo.
Các gen sau khi dự đốn được chú giải trên cơ sở dữ liệu NR (non- redundant) bằng phần mềm Blast ++ [83] với e-value = 1e-6. Những kết quả tương đồng trên cơ sở dữ liệu NR tiếp tục được chú giải trên cơ sở dữ liệu GO (Gene Ontology) (Ashburner và cs., 2000) và KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) (Kanehisa và Goto, 2000) bằng phần mềm Blast2GO (Conesa và cs.,2005) với các thơng số mặc định. AntiSMASH (antibiotics and secondary metabolite analysis shell) là phần mềm chạy từ web server tìm các cụm gen tham gia vào con đường sinh tổng hợp enzym bằng thuật tốn profile hidden Markov model (pHMM) (Weber và cs., 2015). AntiSMASH sẽ dự đốn bằng Prodigal với vi khuẩn đã tích hợp sẵn. NaPDos là cơng cụ phát hiện và phân tích nhanh các gen chuyển hĩa thứ cấp. Cơng cụ này được thiết kế và phát hiện domain C và KS từ dữ liệu DNA hoặc axit amin. Các domain chuyển hĩa thứ cấp được xác định bằng so sánh trình tự với tập hợp các gen tham chiếu từ các con đường hĩa học. Trình tự gen được tiên đốn sản phẩm tạo thành và xác định những sản phẩm này cĩ thể tạo ra những chất tương tự hay các con đường sinh tổng hợp đã biết.
Bản đồ đồ họa của hệ gen trịn được tạo bằng PATRIC (Wattam và cộng sự) [84]. Trình tự hệ gen dự thảo được gửi vào cơ sở dữ liệu GenBank (NCBI) theo số gia nhập: JAFGYF000000000
Phân tích sự giống nhau của tồn bộ hệ gen
Để phân loại chủng MP1 đến cấp độ lồi, sự tương đồng của tồn bộ hệ gen được tính tốn nhận dạng nucleotide trung bình (ANI) và lai DNA-DNA kỹ thuất sơ (dDDH) đã được thực hiện.ANI được tính tốn bằng cách sử dụng nhận dạng nucleotide trung bình trực giao (OrthoANI) [85]. Dữ liệu trình tự bộ gen MP1 đã được tải lên máy chủ để phân tích phân loại (http://tygs.dsmz.de).
Hệ gen so sánh và dự đốn hoạt tính Carbohydrate giũa chủng MP1 và 3 lồi
C.cellulans khác cĩ trong GenBank, bao gồm J36 (NZ_JAGJ01000000.1).
2.5. Các phƣơng pháp phân tich 2.5.1. Xác định hoạt độ các enzyme 2.5.1. Xác định hoạt độ các enzyme
Hoạt độ endoglucanase
Hoạt tính CMCase (mol/phút/ml) =
[87] Trong đĩ :
D : Hàm lượng đường khử dựa vào giá trị OD của đường chuẩn 103 : Hệ số chuyển đổi
180: Phân tử lượng Glucose 30 : Thời gian phản ứng f : Hệ số pha lỗng
1,5: Tổng thể tích phản ứng
0,5: Thể tích enzym tham gia phản ứng
Hoạt độ cellulase tổng số (FPU)
Hoạt độ cellulase tổng số được xác định theo phương pháp của Ghose. Lấy 0,5 ml dịch enzym với 1ml dung dich đệm Xitrat 50mM ( pH = 4,8), cơ chất là giấy lọc kích thước 1,0 x 6,0 cm trong đệm, ủ hỗn hợp ở 50 C trong 60 phút. Lượng đường khử tạo thành được xác định bằng phương pháp DNS ở bước sĩng 540nm với chất chuẩn là glucose.
Một đơn vị hoạt tính FPU (U/ml) được định nghĩa là lượng enzym cần tiết để thủy phân cơ chất giấy lọc thành 1µmol glucose trong thời gian 1 phút trên thể tích 1ml
Hoạt tính FPU (mol/phút/ml) =
Trong đĩ :
D : Hàm lượng đường khử dựa vào giá trị OD của đường chuẩn 103 : Hệ số chuyển đổi
180: Phân tử lượng Glucose 60 : Thời gian phản ứng f : Hệ số pha lỗng
1,5: Tổng thể tích phản ứng
0,5: Thể tích enzym tham gia phản ứng .
Hoạt độ exoglucanase
Hoạt độ Acevilase được xác định theo phương pháp của Ghose. Lấy 0,5 ml dịch enzym với 1,5 ml dung dich đệm citrate 50mM ( pH = 4,8), cơ chất là Avicel 1% trong đệm, ủ hỗn hợp ở 50 C trong 60 phút. Lượng đường khử tạo thành được xác định bằng phương pháp DNS ở bước sĩng 540nm với chất chuẩn là glucose.
Một đơn vị hoạt độ exoglucanase là lượng enzym cần thiết để thủy phân Avicel tạo thành 1 μmol glucose trong 1 phút. Lượng đường khử sinh ra được phân tích bằng phương pháp DNS [88]
Hoạt độ exoglucanase được tính theo cơng thức:
Trong đĩ:
2: Tổng thể tích phản ứng (ml) f: Hệ số pha lỗng enzym C: Nồng độ đường khử (mg/ml) 1000: Hệ số quy đổi mmol ra µmol 180: khối lượng phân tử glucose 60: Thời gian phản ứng enzym (phút) 0,5: thể tích enzym phản ứng (ml)
Hoạt độ -glucosidase
Phân tích được tiến hành theo phương pháp của Parry et al. (2001) theo trình tự như sau (cĩ thay đổi cho phù hợp với điều kiện thí nghiệm): 0,5 ml đệm citrate 0,05M pH 4.8 trộn với 0,5 ml p-Nitrophenyl β-D-glucopyranoside (10mM), thêm vào, giữa phản ứng ở 0,5 ml enzym 50oC/ 30 phút. Bổ sung 3 ml đệm NaOH- glycine 0,4M pH 10,8 và đo ở OD405nm
Một đơn vị hoạt độ β-glucosidase là lượng enzym cần thiết để giải phĩng 1 μmol p-nitrophenol trong 1 phút ở điều kiện thí nghiệm. Hoạt độ enzym đo bằng cách đo độ phát quang của cơ chất được giải phĩng ở bước sĩng 405nm
Hoạt độ β-glucosidase được tính theo cơng thức:
Trong đĩ:
1,5: Tổng thể tích phản ứng (ml) f: Hệ số pha lỗng enzym
Hoạt độ β-glucosidase = (U/ml) Hoạt độ exoglucanase = (U/ml)
Hoạt độ xylanase
Phân tích được tiến hành theo phương pháp của Ghose và cộng sự [64] cĩ thay đổi cho phù hợp với điều kiện thí nghiệm, cụ thể như sau: 0,4 ml xylan 1% trộn với 0,4 ml enzym và ủ 50oC, 30 phút. Lượng đường khử sinh ra được phân tích bằng phương pháp DNS.
Một đơn vị hoạt độ xylanase được định nghĩa là lượng enzym cần thiết thủy phân xylanase 1% (pha trong đệm 0,05M citrate pH4,8) để giải phĩng 1µmol xylose trong 1 phút ở pH 4,8, nhiệt độ 50oC.
Hoạt độ xylanase được tính theo cơng thức:
Trong đĩ:
0,8: Tổng thể tích phản ứng f: Hệ số pha lỗng enzym C: nồng độ đường khử (mg/ml) 1000: Hệ số quy đổi mmol ra µmol 150: khối lượng phân tử xylose 30: Thời gian phản ứng enzym (phút) 0,4: thể tích enzyme phản ứng (ml)
2.5.2. Xác định hàm lƣợng protein
Lượng protein trong mẫu enzym được xác định theo phương pháp Lowry [89] tại bước sĩng 756 nm sử dụng chất chuẩn là Albumin huyết thanh bị.
Lượng protein trong mẫu được tính theo cơng thức Hàm lượng protein (g/g hoặc g/ml) =
[89]
a: là hàm lượng protein tương ứng xác định được từ đường chuẩn n: là hệ số pha lỗng mẫu
m: khối lượng hoặc thể tích mẫu đưa vào
2.5.3. Xác định độ ẩm nguyên liệu
Cân chính xác 5g rơm cho vào cốc sạch, khơ đã biết khối lượng trước. Đưa mẫu vào tủ sấy và sấy ở 105ºC đến khối lượng khơng đổi. Sau khi sấy lấy mẫu ra cho vào bình hút ẩm để làm nguội, cân. Tiếp tục sấy đến khối lượng khơng đổi. Khi kết quả giữa 2 lần cân cuối cùng cĩ sai số ± 0,5 là coi như khối lượng khơng đổi.
Tính độ ẩm nguyên liệu
X (%) = - × 100
Trong đĩ: m1: Khối lượng mẫu trước khi sấy m2: Khối lượng mẫu sau khi sấy
m: Khối lượng mẫu trước khi sấy
2.5.4. Xác định hàm lƣợng cellulose [90]
Mẫu được nghiền nhỏ thích hợp, sau đĩ xử lý lần lượt bằng dung dịch axit sulfuric và dung dịch natrihydroxit đun sơi. Cặn được tách bằng cách lọc, rửa, sấy khơ, cân sau đĩ tro hĩa. Sự hao hụt khối lượng sau khi tro hĩa được gọi là cellulose [90]
Cân 2 - 3g mẫu cho vào bình hình cầu dung tích 1 lit, thêm vào 200ml dung dịch H2SO4 1,5%, lắp sinh hàn sau đĩ gia nhiệt đến sơi trong khoảng 30 phút. Lọc dung dịch qua giấy lọc và rửa lại nhiều lần bằng nước cất đun sơi cho đến khi khơng