2.5.1. Xác định hoạt độ các enzyme
Hoạt độ endoglucanase
Hoạt tính CMCase (mol/phút/ml) =
[87] Trong đĩ :
D : Hàm lượng đường khử dựa vào giá trị OD của đường chuẩn 103 : Hệ số chuyển đổi
180: Phân tử lượng Glucose 30 : Thời gian phản ứng f : Hệ số pha lỗng
1,5: Tổng thể tích phản ứng
0,5: Thể tích enzym tham gia phản ứng
Hoạt độ cellulase tổng số (FPU)
Hoạt độ cellulase tổng số được xác định theo phương pháp của Ghose. Lấy 0,5 ml dịch enzym với 1ml dung dich đệm Xitrat 50mM ( pH = 4,8), cơ chất là giấy lọc kích thước 1,0 x 6,0 cm trong đệm, ủ hỗn hợp ở 50 C trong 60 phút. Lượng đường khử tạo thành được xác định bằng phương pháp DNS ở bước sĩng 540nm với chất chuẩn là glucose.
Một đơn vị hoạt tính FPU (U/ml) được định nghĩa là lượng enzym cần tiết để thủy phân cơ chất giấy lọc thành 1µmol glucose trong thời gian 1 phút trên thể tích 1ml
Hoạt tính FPU (mol/phút/ml) =
Trong đĩ :
D : Hàm lượng đường khử dựa vào giá trị OD của đường chuẩn 103 : Hệ số chuyển đổi
180: Phân tử lượng Glucose 60 : Thời gian phản ứng f : Hệ số pha lỗng
1,5: Tổng thể tích phản ứng
0,5: Thể tích enzym tham gia phản ứng .
Hoạt độ exoglucanase
Hoạt độ Acevilase được xác định theo phương pháp của Ghose. Lấy 0,5 ml dịch enzym với 1,5 ml dung dich đệm citrate 50mM ( pH = 4,8), cơ chất là Avicel 1% trong đệm, ủ hỗn hợp ở 50 C trong 60 phút. Lượng đường khử tạo thành được xác định bằng phương pháp DNS ở bước sĩng 540nm với chất chuẩn là glucose.
Một đơn vị hoạt độ exoglucanase là lượng enzym cần thiết để thủy phân Avicel tạo thành 1 μmol glucose trong 1 phút. Lượng đường khử sinh ra được phân tích bằng phương pháp DNS [88]
Hoạt độ exoglucanase được tính theo cơng thức:
Trong đĩ:
2: Tổng thể tích phản ứng (ml) f: Hệ số pha lỗng enzym C: Nồng độ đường khử (mg/ml) 1000: Hệ số quy đổi mmol ra µmol 180: khối lượng phân tử glucose 60: Thời gian phản ứng enzym (phút) 0,5: thể tích enzym phản ứng (ml)
Hoạt độ -glucosidase
Phân tích được tiến hành theo phương pháp của Parry et al. (2001) theo trình tự như sau (cĩ thay đổi cho phù hợp với điều kiện thí nghiệm): 0,5 ml đệm citrate 0,05M pH 4.8 trộn với 0,5 ml p-Nitrophenyl β-D-glucopyranoside (10mM), thêm vào, giữa phản ứng ở 0,5 ml enzym 50oC/ 30 phút. Bổ sung 3 ml đệm NaOH- glycine 0,4M pH 10,8 và đo ở OD405nm
Một đơn vị hoạt độ β-glucosidase là lượng enzym cần thiết để giải phĩng 1 μmol p-nitrophenol trong 1 phút ở điều kiện thí nghiệm. Hoạt độ enzym đo bằng cách đo độ phát quang của cơ chất được giải phĩng ở bước sĩng 405nm
Hoạt độ β-glucosidase được tính theo cơng thức:
Trong đĩ:
1,5: Tổng thể tích phản ứng (ml) f: Hệ số pha lỗng enzym
Hoạt độ β-glucosidase = (U/ml) Hoạt độ exoglucanase = (U/ml)
Hoạt độ xylanase
Phân tích được tiến hành theo phương pháp của Ghose và cộng sự [64] cĩ thay đổi cho phù hợp với điều kiện thí nghiệm, cụ thể như sau: 0,4 ml xylan 1% trộn với 0,4 ml enzym và ủ 50oC, 30 phút. Lượng đường khử sinh ra được phân tích bằng phương pháp DNS.
Một đơn vị hoạt độ xylanase được định nghĩa là lượng enzym cần thiết thủy phân xylanase 1% (pha trong đệm 0,05M citrate pH4,8) để giải phĩng 1µmol xylose trong 1 phút ở pH 4,8, nhiệt độ 50oC.
Hoạt độ xylanase được tính theo cơng thức:
Trong đĩ:
0,8: Tổng thể tích phản ứng f: Hệ số pha lỗng enzym C: nồng độ đường khử (mg/ml) 1000: Hệ số quy đổi mmol ra µmol 150: khối lượng phân tử xylose 30: Thời gian phản ứng enzym (phút) 0,4: thể tích enzyme phản ứng (ml)
2.5.2. Xác định hàm lƣợng protein
Lượng protein trong mẫu enzym được xác định theo phương pháp Lowry [89] tại bước sĩng 756 nm sử dụng chất chuẩn là Albumin huyết thanh bị.
Lượng protein trong mẫu được tính theo cơng thức Hàm lượng protein (g/g hoặc g/ml) =
[89]
a: là hàm lượng protein tương ứng xác định được từ đường chuẩn n: là hệ số pha lỗng mẫu
m: khối lượng hoặc thể tích mẫu đưa vào
2.5.3. Xác định độ ẩm nguyên liệu
Cân chính xác 5g rơm cho vào cốc sạch, khơ đã biết khối lượng trước. Đưa mẫu vào tủ sấy và sấy ở 105ºC đến khối lượng khơng đổi. Sau khi sấy lấy mẫu ra cho vào bình hút ẩm để làm nguội, cân. Tiếp tục sấy đến khối lượng khơng đổi. Khi kết quả giữa 2 lần cân cuối cùng cĩ sai số ± 0,5 là coi như khối lượng khơng đổi.
Tính độ ẩm nguyên liệu
X (%) = - × 100
Trong đĩ: m1: Khối lượng mẫu trước khi sấy m2: Khối lượng mẫu sau khi sấy
m: Khối lượng mẫu trước khi sấy
2.5.4. Xác định hàm lƣợng cellulose [90]
Mẫu được nghiền nhỏ thích hợp, sau đĩ xử lý lần lượt bằng dung dịch axit sulfuric và dung dịch natrihydroxit đun sơi. Cặn được tách bằng cách lọc, rửa, sấy khơ, cân sau đĩ tro hĩa. Sự hao hụt khối lượng sau khi tro hĩa được gọi là cellulose [90]
Cân 2 - 3g mẫu cho vào bình hình cầu dung tích 1 lit, thêm vào 200ml dung dịch H2SO4 1,5%, lắp sinh hàn sau đĩ gia nhiệt đến sơi trong khoảng 30 phút. Lọc dung dịch qua giấy lọc và rửa lại nhiều lần bằng nước cất đun sơi cho đến khi khơng cịn axit, dùng giấy pH để thử. Tiếp tục dùng 200ml dung dịch NaOH nồng độ khoảng 2-5% và gia nhiệt đến sơi trong vịng 30 phút để tiếp tục thủy phân. Thêm 2-3 giọt chất chống tạo bọt và tiến hành quá trình như xử lý. Lọc dung dịch sau đĩ rửa bã nhiều lần bằng nước cất và HCl 1% đến khi hết kiềm, dùng giấy pH để thử.
Chuyển tồn bộ xơ bã vào một chén nung đã sấy khơ, cân bì. Sấy chén cĩ xơ bã trong tủ sấy ở nhiệt độ 1050C trong 1 giờ, để nguội, cân. Sấy lại cho đến khối lượng khơng đổi.
Chuyển chén nung vào lị nung, nung đến tro trắng, làm nguội trong bình hút ẩm, cân. Nung đến khối lượng khơng đổi.
Hàm lượng cellulose thơ cịn được tính bằng % theo khối lượng chất khơ như sau:
X (%) =
Trong đĩ:
Mo – Khối lượng của mẫu, tính bằng g;
M1 - khối lượng chất xơ và cặn sau khi sấy, tính bằng g;
M2 – Khối lượng chất xơ và cặn sau khi đốt nĩng trong lị nung, tính bằng g Wo - Hàm lượng chất khơ của mẫu, biểu thị theo %
Cân 0,3g mẫu vào ống nghiệm, ghi lại khối lượng mẫu (chính xác đến 0,1mg). Thêm 3ml NaOH 2M, dùng đũa thủy tinh khuấy nhẹ nhàng sau đĩ để luơn đũa trong ống. Ủ 30°C, 60±5 phút. Mỗi 5-10 phút lại khuấy 1 lần, chú ý khơng nhấc đũa ra khỏi ống nghiệm.
Chuẩn bị các mẫu đối chứng đường (glucose, xylose, galacyose, arabinose, mannose) cĩ nồng độ gần nhất với nồng độ ước tính cĩ trong mẫu phân tích để hiệu chỉnh lượng đường bị phân hủy trong quá trình thủy phân bằng kiềm. Pha 10ml dung dịch đường với nồng độ yêu cầu, thêm 348µl NaOH 2M. Chuyển sang các ống nghiệm thủy tinh và đậy kín. Hấp 121°C, 1h các mẫu đường đối chứng và mẫu phân tích sau đĩ để nguội tự nhiên.
Xác định hàm lượng lignin khơng tan trong kiềm(AIL)
Nung chén ở 575±25°C đến khối lượng khơng đổi (sai lệch khối lượng khơng vượt quá 0.3mg sau 60 phút nung), ghi lại khối lượng chén.
Sấy giấy lọc khơng tro ở 105°C đến khối lượng khơng đổi, ghi lại khối lượng mo. Lọc dịch thủy phân thu được ở bước giấy lọc khơng tro với hệ thống hút chân khơng. Thu khoảng 50ml dịch lọc vào falcon để xác định hàm lượng lignin khơng tan trong acid và carbonhydrate. Mẫu dịch cĩ thể bảo quản tối đa 2 tuần trong vịng 6h kể từ khi kết thúc quá trình thủy phân.
Dùng 50ml nước deion để rửa phần bã cịn lại trên giấy lọc. Dùng nước nĩng cĩ thể giúp quá trình lọc diễn ra nhanh hơn.
Sấy phần rắn đến khối lượng khơng đổi, ít nhất 4h ở 105°C. (khối lượng sau sấy là m1=khối lượng giấy lọc + khối lượng lignin khơng tan trong kiềm + khối lượng tro khơng tan trong kiềm). Chuyển tồn bộ giấy lọc khơng tro và bã sau sấy vào chén nung đã biết trước khối lượng. Nung ở 600°C ± trong 24h ± 6h đến khối lượng khơng đổi (khối lượng sau nung là m2 = khối lượng chén nung + khối lượng tro khơng tan trong kiềm).
Lượng tro khơng tan trong kiềm: mAIR = m2 - m chén nung (g)
Lượng lignin khơng tan trong kiềm: mail =m1 - mgiấy lọc - mAIR (g)
Hàm lượng lignin khơng tan trong kiềm của nguyên liệu đã trích ly: %AIL=100×mAIL / mo
Với:
Mo (g) là khối lượng khơ tuyệt đối của nguyên liệu đem đi phân tích M1 (g) là tổng khối lượng sau khi sấy ở 105°C
Phân tích hàm lượng lignin tan trong kiềm(ASL)
Sử dụng máy đo UV-VIS, set blank bằng nước deion hoặc NaOH
Đo mẫu dịch lọc thu được ở bước sĩng thích hợp, chú ý pha lỗng bằng chính dung dịch set blank sao cho giá trị độ hấp thụ nằm trong khoảng 0.7 đến 1.0
Hàm lượng lignin tan trong kiềm của nguyên liệu đã trích ly: %ASL = (100×OD×V dịch lọc×F) / ( ε ×λ× m )
Trong đĩ :
OD: giá trị độ hấp phụ trung bình của ít nhất 2 lần đo (sai lệch nhỏ hơn 0.05) V dịch lọc : 86,73 ml
F : độ pha lỗng mẫu khi tiến hành đo quang
ε : độ hấp thụ của nguyên liệu ở bước sĩng λtương ứng. Với gỗ cao su, ε= 12, λ= 240nm
m: lượng mẫu đem đi phân tích tính theo khối lượng khơ tuyệt đối (mg) Hàm lượng lignin tổng trong nguyên liệu đã trích ly được tính theo cơng thức %L = %AIL + %ASL [91].
2.5.6. Phƣơng pháp xác định lƣợng đƣờng trong mẫu thủy phân bằng sắc ký lỏng cao áp (HPLC- High Performance Liquid Chromatography)
Phân tích sắc ký được thực hiện trên hệ thống HPLC dịng Agilient 1200 (Agilent Technologies, Hoa Kỳ) được trang bị bộ khử khí chân khơng, một máy bơm nhị phân, bộ lấy mẫu tự động, bộ điều khiển nhiệt tĩnh.
Dịch thủy phân và mẫu kiểm chứng của cơ chất được lọc qua màng lọc 0,2µm, sau đĩ được đưa lên cột sắc ký Aminex 87H (300mm x 7,8mm, 9µm) với dung mơi H2SO4 10mM, tốc độ dịng 0,5 mL/phút ở nhiệt độ 60oC. Mẫu đi qua cột được phát hiện bằng chỉ số khúc xạ
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Phân lập vi khuẩn từ ruột mối và tuyển chọn chủng cĩ hoạt tính cellulase cao cao
Các mẫu mối được thu thập từ tổ mối trên cây gỗ và mía đã mục, trên thân cây ở các địa điểm khác nhau của các huyện Thanh Chương, Nghi Lộc thuộc địa bàn thành phố Vinh và trường Đại học Bách khoa Hà Nội (Bảng 2.1). So sánh đặc điểm hình thái của mối, đặc điểm của tổ mối với tài liệu định danh cho thấy các mẫu mối thu nhận đều cĩ đặc điểm của lồi mối gỗ khơ Coptotermes.
Ở Việt Nam, qua điều tra nhiều năm người ta thấy loại phổ biến nhất thường phá hoại các cơng trình 95-97% (Nguyễn Quốc Huy, 2017) lồi mối Coptotermes
thuộc giống Rhinotermitidae [92]. Tổ mối trong gỗ thường thấy ở lồi mối khơ, tổ nằm gọn trong thanh gỗ khơng cĩ liên hệ gì với đất, tổ cĩ kết cấu đơn giản, quần thể khơng lớn thường cĩ các lỗ thơng từ hang này đến hang khác hoặc thơng ra ngồi
Hình 3.1. Hình ảnh mẫu mối thu thập
Khả năng phân giải cellulose của chủng được đánh giá thơng qua nuơi cấy trên đĩa thạch và thử bằng thuốc thử congo, xác định tỷ lệ đường kính vịng thủy phân với đường kính khuẩn lạc D/d [93][94][95].
Kết quả chi tiết đặc điểm khuẩn lạc và khả năng tạo vịng thủy phân của các chủng phân lập từ ruột mối được trình bày ở phụ lục 1 (Bảng PL1-5). Số lượng chủng phân lập từ các mẫu mối và khả năng tạo vịng thủy phân trên mơi trường nhuơm congo 1% của các chủng phân lập đươc tổng hợp ở bảng 3.1.
Bảng 3.1 Kết quả phân lập vi khuẩn từ ruột mối
Ký hiệu mẫu mối Số lượng chủng phân lập Tỷ lệ D/d ≤2 2-5 ≥5 01 16 5 9 2 02 10 5 5 0
03 18 11 7 0 04 18 9 6 3 05 10 9 0 1 06 7 6 1 0 07 17 10 3 4 08 12 11 0 1 Tổng 108 66 31 11
Kết quả bảng 3.1 cho thấy số lượng vi khuẩn phân lập được từ các mẫu tương đối lớn 108 chủng vi khuẩn. Tuy nhiên tỷ lệ các chủng cĩ tỷ lệ đường kính vịng thủy phân/đường kính khuẩn lạc (D/d) cao lại khơng nhiều. Số lượng chủng cĩ D/d ≥ 5 là 11/108 chiếm 10,2%, số lượng chủng cĩ D/d trong khoảng 2-5 là 31 chủng chiếm 28,7%. Cịn lại phần lớn các chủng cĩ tỷ lệ D/d ≤ 2 chiếm tỷ lệ cao nhất 61,1%.
Các chủng vi khuẩn phân lập từ các mơi trường làm giàu cĩ thành phần khác nhau cũng khơng giống nhau. Các mẫu mối 1, 2, 3, 4 được làm giàu cùng lúc trên 5 loại mơi trường M1, M2, M3, M4 và M5 được tổng kết trên bảng 3.2.
Bảng 3.2 Số lượng các chủng vi khuẩn phân lập được trên các mơi trường làm giàu
STT Mơi trường làm giàu Số chủng Tỷ lệ (%) Cơ chất CMC Cơ chất giấy lọc 1 M1 16 25,81% 8 8 2 M2 13 20,97% 7 6 3 M3 19 30,65% 8 11 4 M4 8 12,90% 2 6 5 M5 6 9,68% 3 3 Tổng 62 28 34
Kết quả bảng 3.2, cho thấy các mơi trường làm giàu M1 và M3 là mơi trường khống nghèo dinh dưỡng cho số lượng chủng loại lớn hơn so với các mơi trường cịn lại. Mơi trường M4 và M5 là mơi trường M3 bổ sung thêm glucose và M2 là
Các chủng cĩ khả năng sinh cellulase cao là những chủng cĩ tỷ lệ D/d > 5 [71]. Trong nghiên cứu này để đảm bảo lựa chọn được các chủng cĩ hoạt độ cellulase cao vừa đảm bảo tính đa dạng, các chủng cĩ tỷ lệ D/d từ 4,8 trở lên, cĩ hình thái khuẩn lạc khác nhau từ các mẫu mối, trên mơi trường làm giàu và cơ chất làm giàu khác nhau được lựa chọn và tổng hợp ở bảng 3.3. Cĩ thể thấy chủng cĩ tỷ lệ D/d cao nhất đạt giá trị 10 là chủng G4.
Kết quả bảng 3.3 so sánh với nghiên cứu của Pratima Gupta và cộng sự (2011) cho thấy cĩ sự tương đương, trong nghiên cứu của Gupta đã phân lập được 4 chủng vi khuẩn cĩ khả năng phân giải cellulose từ ruột mối trên mơi trường khống, nghèo dinh dưỡng trong thời gian 7 ngày, các chủng phân lập cĩ tỷ lệ đường kính vịng thủy phân/ đường kính khuẩn lạc D/d dao động từ 4,32 đến 5,49 và tỷ lệ D/d lớn nhất là 9 [94]. Trong một nghiên cứu khác của tác giả NYI Merkar Saptarini khi tiến hành phân lập trên mối và nguồn cacbon chủ yếu là lõi ngơ. Kết quả phân lập được 3 chủng cĩ tỷ lệ D/d trong khoảng 5,02 – 5,24 [71]. So với các nghiên cứu đã cơng bố thì kết quả của chúng tơi là khả quan khi cĩ 2 chủng với tỷ lệ D/d trong khoảng từ 8-10.
Bảng 3.3 Các chủng cĩ tỷ lệ (D/d) cao được chọn lựa
STT Cơ chất sử dụng cho quá trình làm giàu
Mẫu mối Mơi trường làm giàu Tên chủng Tỷ số D/d 1 CMC 01 M5 G4 10 2 05 M2 T2-11 8 3 06 M1 TM1-7-1 4,8 4 07 M1 D1-8 5 5 07 M1 D1-12 5,5 6 08 M2 CM2-4 6,6 7 Giấy lọc 04 M1 MP1 7,5 8 04 M3 MP3 6,5 9 Cơ chất tự nhiên cám gạo, đậu tương
07 M6 CG2 4,8
10 07 M6 CG4 5,0
11 07 M6 CG4-1-2- 6,3
Các chủng vi khuẩn cĩ tỷ lệ đường kính vịng thủy phân cao tiếp tục được nuơi trên mơi trường lỏng LB với cơ chất CMC và bã mía 0,5%, ở nhiệt độ 370
C, lắc 150 vịng/phút. Kết quả xác định hoạt độ enzym tương ứng (Bảng 3.4 và Hình 3.2).
Bảng 3.4 Hoạt độ cellulase và xylanase của các chủng vi khuẩn lựa chọn TT Ký hiệu chủng Hoạt độ CMCase (U/mL) Hoạt độ FPU (U/mL) Hoạt độ Xylanase (U/mL) Hoạt độ β- glucosidase (U/mL) Hoạt độ exoglucanase (U/mL) 1 TM1- 7.1 0,144±0,011 0,016±0,008 0,041±0,003 0,165±0,012 ND 2 MP3 0,440±0,024 0,020±0,003 0,12±0,012 0,098±0,005 0,0051±0,0006 3 MP1 0,652±0,033 0,057±0,005 0,23±0,016 0,153±0,005 0,0038±0,0007 4 CG2 0,197±0,012 0,020±0,004 0.041±0,011 0,117±0,009 0,0044±0,0004 5 G4 0,754±0,046 0,026±0,006 0,170±0,012 0,124±0,005 0,0046±0,0005 6 CG4 0,144±0,010 0,024±0,004 0,034±0,001 0,117±0,004 0,0034±0,0001