Các lồi mối phụ thuộc rất nhiều vào các enzym do vi sinh vật tạo ra để cĩ thể phân hủy được cellulose. Cĩ những loại mối mà việc thủy phân do hệ vi sinh vật
ruột mối bậc thấp và bậc cao. Serratia marcescenes, Enterobacter aerogenes, Enterobacter cloacae và Citrobacter farmeri đã được phân lập từ
Coptotermes formosanus trong khi đĩ E. aerogenes, E. cloacae và Clavibacter agropyri đã được chứng minh là tồn tại trong ruột mối C. curvignathus. Tương tự, Husseneder và cộng sự cũng đã phân lập từ C. formosanus 25 chủng vi khuẩn, thuộc các họ Enterobacteriaceae, bộ Bacteroidales và Lactobacillales [37].
Hongoh và cộng sự (2006) đã xác định được vi khuẩn ngành Fibrobacteres (chiếm khoảng 10%) cùng với vi khuẩn thuộc bộ Bacteroidales và Clostridiales chỉ đứng sau chi Treponema về độ đơng đúc trong đường ruột của mối
Microcerotermes Spirochaetes [38].
Gần đây, các nghiên cứu khơng thơng qua nuơi cấy đã chứng minh nhiều hơn về sự đa dạng vi sinh vật ruột mối, đặc biệt là đa dạng vi khuẩn. Bằng phân tích trình tự 16S rRNA của vi khuẩn được khuếch đại từ metagenome của hệ vi sinh ruột mối, tổng số hơn 1500 phylotype (tương đương với lồi, tuy nhiên khơng nuơi cấy và định tên được, chỉ cĩ thể xác định được thơng qua trình tự 16S rRNA) của vi khuẩn đã được phân tích và được phân loại vào 24 nhĩm ngành khác nhau. Phần lớn chúng chưa bao giờ được tìm thấy ở trong các mơi trường sống khác và cho thấy độ tương đồng thấp với các chủng vi khuẩn nuơi cấy được [17].
Ở Việt Nam đã cĩ các nghiên cứu tiếp cận phương pháp metagenomic để đánh giá về sự đa dạng của hệ vi sinh vật trong ruột mối. Với phương pháp metagenomic (nghiên cứu đa bộ gen) cĩ sự nổi trội vượt bậc vì cĩ thể đánh giá được sự đa dạng về gen trong một quần thể vi sinh vật và đặc biệt nhất đĩ là cĩ thể cho thấy được cả sự tồn tại của cả những cá thể khơng thể nuơi cấy được. Và bằng phương pháp này, hệ vi sinh vật trong ruột mối thuộc lồi Coptotermes gestroi đã được phân tích và cho ra kết quả trong hình 1.3.
Hình 1.3. Hệ vi sinh vật trong ruột mối [39]
Chi mối Coptotermes được nghiên cứu Nguyễn Thanh Ngọc và cộng sự là chi mối cĩ mặt phổ biến nhất tại Việt Nam, và sự đa dạng sinh học trong ruột mối cĩ thể thấy, Firmicutes, Proteobacteria, Spriochaetes là 3 ngành vi khuẩn chiếm số lượng lớn nhất trong ruột mối này nhưng vẫn cĩ một lượng lớn những ngành vi khuẩn khác và ngồi ra thì cịn sự cĩ mặt của những vi khuẩn chưa được phân ngành. Xạ khuẩn Actinobacteria cũng cĩ mặt trong ruột mối nhưng với một số lượng vơ cùng khiêm tốn so với các ngành khác [17].
Các nghiên cứu gần đây của Đỗ Thị Huyền, Nguyễn Thị Thảo và cộng sự cũng đã sử dụng phương pháp giải trình tự tồn bộ hệ gen vi khuẩn trong ruột mối để đánh giá sự đa dạng vi khuẩn cĩ khả năng sinh cellulase từ ruột mối ở Việt Nam.
1.2.3 Phân lập vi khuẩn sinh cellulase từ ruột mối
Cĩ nhiều phương pháp để nghiên cứu hệ enzym trong ruột mối, đĩ là các phương pháp tách các enzym từ ruột mối và nghiên cứu các đặc tính của chúng, phương pháp khác là phân lập, nuơi cấy các vi sinh vật trên mơi trường tổng hợp một cách riêng rẽ sau đĩ tìm ra được các chủng cĩ khả năng sinh enzym và thực hiện các phương pháp lên men để thu nhận. Với phương pháp phân lập chỉ cĩ rất ít vi sinh vật cĩ thể nuơi cấy được mới cĩ thể sử dụng. Phương pháp mới gần đây nữa là các phương pháp sinh học phân tử nhằm tìm kiếm các gen cĩ khả năng mã hĩa sinh tổng hợp các enzym từ đĩ đã phát hiện ra một số vi sinh vật tiềm năng trong ruột mối
Lysinibacillus fusifimics và Bacillus cereus là các lồi vi khuẩn phân lập được từ mối đất Psammotermes hypostoma Desneux thuộc họ Rhinotermitidae ở Ai Cập [40] và đều cĩ hoạt tính endoglucanase dao động từ 0,22 U/ml đến 2,28 U/ml. Trong số các chủng vi khuẩn phân lập được từ ruột mối ăn gỗ tại Ấn Độ cĩ 70% thuộc họ Bacillaceae, 23% thuộc họ Enterobacteriaceae, 7% thuộc họ Paenibacillaceae. Các chủng đều thể hiện hoạt tính endoglucanase thêm 1 hay nhiều hơn hoạt tính cellulase như cellobiohydrolase hoặc avicelase hoặc β-glucosidase. Ngồi ra nhiều chủng cịn biểu hiện hoạt tính hemicellulase như mannase, xylanase [41]. Trong nghiên cứu của Ferbiyanto, 2 chủng phân lập được từ mối
Macrotermes gilvus sp thuộc họ Termitidae thu thập tại Indonesia cĩ tỷ lệ đường kính vịng thủy phân/đường kính khuẩn lạc cao từ 2,81-3,5 các chủng này đã được định tên kết quả cho thấy chúng thuộc lồi Bacillus megaterium và Paracoccus yeei
[42].
Ba chủng vi khuẩn thuộc các chi Acinetobacter, Pseudomonas, Staphylococus và bốn chủng thuộc họ Enterobacteriaceae, Bacillaceae được phân lập từ mối Microcerotermes diversus thuộc họ Termitidae thu thập tại Iran. Trong đĩ 2 chủng Bacillus sp B5B và Acinetobacter sp.L9B cĩ hoạt tính endoglucanase cao nhất đạt 1,47 U/ml và 1,22 U/ml tương ứng [43]. Nghiên cứu của Wenzel và cộng sự đã phân lập được 119 chủng vi khuẩn cĩ khả năng sinh cellulase từ mối bậc thấp Zootermopsis angusticoliss. Các chủng phân lập được thuộc các chi
Cellulomonas/Oerskovia, Microbacterium, Kocuria, Bacillus, Brevibacillus, Paenibacillus, Afipia, Agrobacterium/Rhizobium, Brucella/Ochrobactrum, Pseudomonas và Sphingomonas/Zymomonas trong đĩ phần lớn các chủng thuộc 2 chi Bacillus và Paenibacillus. Các chủng cĩ vịng thủy phân lớn chủ yếu thuộc chi
Cellulomonas, Bacillus và Paenibacillus [9].
Hiện tại cĩ nhiều vi khuẩn trong ruột mối vẫn chưa nuơi cấy được do việc tạo điều kiện mơi trường nuơi cấy tương tự như trong ruột mối là khĩ khăn. Khơng một lồi nào được phân lập trong mơi trường yếm khí ( 100% và 85%/ 15%). Các lồi được phân lập chủ yếu trong mơi trường hiếu khí hoặc vi hiếu khí, do cịn một phần oxy cĩ thể thấm qua thành ruột và khơng thể ngăn cản sự truyền oxy trong quá trình nghiền thức ăn của ruột [31].
Khoảng 42 khuẩn lạc đã được lựa chọn theo phương pháp sàng lọc dựa trên phân tích sinh học và phân tích hoạt động enzym. Phân tích trình tự 16S rDNA cho thấy tất cả các lồi vi khuẩn đã xác định thuộc 5 họ - 50% thuộc về Bacillaceae, 26% thuộc về Enterobacteriaceae, 17% thuộc về Microbacteriaceae, 5% thuộc về
Paenibacillaceae và 2% thuộc về Promicromonosporaceae. Từ 60 đến 70% vi khuẩn từ ruột của mối đến từ Họ Bacillaceae (Hình 1.4) [41]
Hình 1.4 Phân bố các họ vi khuẩn trong ruột mối và cơn trùng [41].
Bảng 1.4 liệt kê các lồi vi khuẩn được phân lập từ các lồi mối khác nhau cùng với khả năng sinh tổng hợp cellulase của chúng. Cĩ thể thấy các chủng thuộc chi Bacillus chiếm lượng lớn các lồi vi khuẩn phân lập được ở hầu hết các lồi mối. Các vi khuẩn từ ruột mối cĩ khả năng biểu hiện hầu hết hoạt tính của hệ cellulase như Endoglucanase, Cellobiohydrolase, -glucosidase, Filter cellulase tuy nhiên hoạt tính chiếm đa số là Endoglucanase
Bảng 1.4. Các vi khuẩn phân lập từ các lồi mối [31].
Vi khuẩn Enzym Lồi mối
Acinetobacter sp. EG, βG Coptotermes curvignathus B. cereus EG, FP Zootermopsis angusticollis
B. cereus EG Reticulitermes Hesperus
B. cereus EG, βG Coptotermes curvignathus B. circulans EG, FP Zootermopsis angusticollis B. megaterium EG, FP Zootermopsis angusticollis Bacillus sp. βG Reticulitermes santonensis Bacillus sp. CBH,βG,EG Reticulitermes speratus Cellulomonas sp. EG, FP Zootermopsis angusticollis Chryseobacterium sp. CBH, βG, EG Reticulitermes speratus
Enterobacter aerogenes EG, βG Coptotermes curvignathus Klebsiella sp. βG Reticulitermes santonensis Klebsiella sp. CBH, βG, EG Reticulitermes speratus Kocuria varians EG, FP Zootermopsis angusticollis Microbacterium sp. EG, FP Zootermopsis angusticollis Ochrobactrum sp. EG, FP Zootermopsis angusticollis Paenibacillus sp. EG, FP Zootermopsis angusticollis Paenibacillus sp. EG, FP Microcerotermes diversus Serratia marcescens EG Reticulitermes Hesperus Serratia sp. CBH, βG, EG Reticulitermes speratus Sphingomonas echinoides EG, FP Zootermopsis angusticollis Sphingomonas sp EG, FP Zootermopsis angusticollis Staphylococcus sp. EG, FP Microcerotermes diversus Streptomyces sp. EG, FP Armitermes
EG: Endoglucanase – FPU: Filter Paper-cellulase – βG: β-glucosidase – CBH: Cellobiohydrolase
1.3. Ứng dụng cellulase trong phân giải sinh khối 1.3.1. Thành phần Lignocellulose
Lignocellulose là thành phần chính của thực vật thân gỗ và các thực vật khác như cỏ, lúa, ngơ…gồm 3 hợp phần chính là cellulose, hemicellulose và lignin
Cellulose
Cellulose là polyme đồng nhất cĩ cấu trúc ổn định, là polyme mạch thẳng của các phân tử glucose liên kết với nhau bằng liên kết β-1,4 glucosid. Cellulose bao gồm cả phần tinh thể và phần vơ định hình, từ các phân tử D-gluocose. Cellulose khơng giống như tinh bột khơng cuộn xoắn và khơng phân nhánh [44]. Dạng tồn tại khác đĩ là việc hình thành nên các dạng hình que hoặc dạng sợi bằng việc tạo ra các nhĩm lân cận phân từ glucose. Nhiều nhĩm OH trên phân tử glucose từ một chuỗi lên kết H với O tạo với các nhĩm OH khác hình thành nên các chuỗi giống nhau, liên kết với nhau tạo nên hệ vi sợi vững chắc. Cellulose cĩ thể hình thành nên các hệ sợi nhỏ là nhờ các liên kết bên trong hoặc bên ngồi chuỗi tạo nên cấu trúc cứng và ổn định của cellulose. Cấu trúc vững chắc này đĩng vai trị quan trọng trong cấu tạo của thành tế bào, tại đĩ các hệ vi sợi là các mắt lưới hình thành nên các ma trận hydratcacbon, cấu tạo này liên quan tới sự vững chắc của tế bào thực vật. Hằng năm, cĩ một lượng lớn cellulose từ các mảng thực vật khơ hình thành và chiếm từ 35% - 50% trữ lượng cellulose [24].
Hình 1.5 Cình 1.5L_CITATION {"citationItems":[{[9]
Các gốc D- glucose trong cellulose thường lệch nhau một gĩc 1800 và cĩ dạng như một chiếc ghế bành [45].
Hình 1.6 Cình 1.6L_CITATIOphân túc hĩa hTIO [9]
Hemicellulose
Hemicellulose cũng là các đại phân tử nhưng mạch cấu tạo từ các đường 5 cacbon pentose và các đường 6 cacbon hexose tuy nhiên đường 5 cacbon là chủ yếu. Hemicellulose tạo liên kết với cellulose tạo nên cấu trúc thành tê bào thực vật.
Về thành phần, hemicellulose bao gồm các polysaccharid như xylan (22.5%), arabinan (1.3%), galactan (1.3%) và mannan (3.4%). Các polysaccharid này được hình thành từ các đường đơn như D-xylose, D-mannose, D-glucose, D-galactose, L- arabinose. Do hemicellulose trong bã mía chứa nhiều đường xylose, nên thường được sử dụng để sản xuất xylitol [79]. Đối với các loại gỗ mềm và các loại cỏ, bèo …, phần lớn đường pentose trong hemicellulose là mannose, trong khi đĩ đối với gỗ cứng là đường 5 xylose. Do mạch hemicellulose ngắn hơn và cĩ cả mạch nhánh nên so với cellulose thì hemicellulose dễ bị thủy phân hơn [46].
Hình 1.7 Cơng thức hĩa học của hemicellulose [29]
Lignin
Thành phần thứ ba của lignocellulose là lignin. Lignin là một polyme dạng vịng, cĩ cấu trúc bậc 3 của mạng polyphenol thơm, bao gồm các đơn phân phenylpropannoid, dẫn xuất của n-hydroxycinnamyl alcohol được dimethoxyl hĩa (syringyl), monomethoxyl hĩa (guaiacyl) hoặc khơng được methoxyl hĩa (p- hydroxyphenil) [47]. Lignin là phân tử kỵ nước và bền với các tác nhân phân giải hĩa học và sinh học, đĩng vai trị như lớp kết dính giữa các tế bào thực vật và các lớp màng tế bào, tạo với hemicellulose và cellulose một kết cấu trong đĩ các sợi cellulose được bảo vệ khỏi các tác nhân bên ngồi. Lignin liên kết với các thành phần polysaccharid của lignocellulose bằng các liên kết cộng hĩa trị bởi nhiều dạng liên kết etherbenzylic, esterbenzyle, glycoside và acetyle [48].
Hình 1.8 Các đơn phân của lignin
Sinh khối tạo thành từ Lignocellulose chiếm khoảng 50% tổng lượng sinh khối thực vật trên thế giới với ước tính trong khoảng 10-50 tỷ tấn [44].
1.3.2. Hệ enzym phân giải Lignocellulose
Ngồi các enzym thuộc nhĩm cellulase tham gia vào quá trình thủy phân lignocellulose cịn cĩ hệ hemicellulase và hệ enzym phân giải lignin tham gia đồng thời vào quá trình phân giải các sinh khối thực vật.
Hemicellulase gồm một nhĩm các enzym thủy phân các galactan, xylan, mannans và araban. Các enzym chính trong hệ hemicellulase bao gồm: Endoxylanase (EC3.2.1.8, 1,4-β-d xylan xylanohydrolase), enzym này thủy phân liên kết β-d xylano pyranosyl của xylan thành các dạng xylo-oligosaccharide; β-D xylosidase (EC 3.2.1.3, xylobiase) xúc tác thủy phân các xylobiose hoặc xylo- oligosaccharide từ đầu khơng khử, sản phẩm tạo thành là các đường D-xylose [49].
Cellulase và Hemicellulase là các glycoside hydrolase (GHs), chúng phân cắt các liên kết glycoside giữa hai hay nhiều hơn các carbohydrate hoặc giữa các carbohydrate với nửa khơng phải carbohydrate. GHs được phân loại dựa trên trình tự protein và các chuỗi peptid, nĩ khơng cĩ hoạt tính đặc hiệu. Hiên nay cĩ 133 họ GHs. Ngồi họ GHs, cĩ nhiều enzym carbohydrate khác cĩ hoạt tính phân cắt cellulose và hemicellulose. Các enzym này được chia làm 3 nhĩm: polysaccharide lyases (PLs), carbohydrate esterases (CEs) và họ enzym hoạt hĩa bổ trợ (AAs). Một nhĩm các protein quan trọng khác cĩ sự liên kết với các enzym hoạt hĩa carbohydrate đĩ là các carbohydrate binding modules (CBMs). Cĩ khoảng 68 họ CBM được liệt kê trong CAZy, cũng được phân loại bởi trình tự và cấu trúc gấp nếp, chúng nhận dạng các tinh thể cellulose, các cellulose vơ định hình và cấu tạo của hemicellulose cũng như các carbonhydrate khác. CBMs đĩng vai trị quan trọng trong việc khoanh vùng chính xác để enzym carbohydrate tấn cơng cơ chất [50].
Endoglucanase của nấm mốc quá trình xúc tác nĩi chung khơng tạo ra các carbohydrate –binding modules (CBM) trong khi đĩ các endoglucanase của vi khuẩn cĩ thể tạo ra các CBM [11].
Hình 1.9 Hoạt động của các enzym hemicellulase [51]
Hệ enzym phân giải lignin tham gia vào sự chuyển hĩa lignocelluloses gồm cĩ laccase, lignin peroxidase (LiP) và manganese peroxidase (MnP).
Laccase là một chất oxy hĩa đa nhân được thu nhận từ vi khuẩn và nấm. Laccase tồn tại dưới dạng isoenzym, oxy hĩa các hợp chất tự nhiên bao gồm phenol, polyphenol, anilin, các hợp chất vơ cơ, hữu cơ khác. Do đĩ laccase được ứng dụng nhiều như tẩy trắng bột giấy, tẩy màu thuốc nhuộm vải, chế biến thực phẩm, sử dụng tổng hợp chất hữu cơ, xử lý các nguồn nước bị ơ nhiễm, xử lý phụ phẩm nơng nghiệp để tạo nguyên liệu cho các quá trình khác.
Lignin peroxidase (LiP) là một glycoprotein, cấu trúc tinh thể được tạo thành từ xoắn α, cĩ 2 ion canxi và 4 liên kết disulfua để ổn định cấu trúc bậc 3. LiP gián tiếp phân hủy lignin thơng qua việc oxy hĩa rượu veratry thành gốc cation khuếch tán tương ứng như một chất oxy hĩa trực tiếp trên lignin.
Mangan peroxydase (MnP) là một protein hem được glycosyl hĩa và là peroxydase phân giải chất béo chính của basidiomycetes. Cấu trúc tinh thể MnP bao gồm ion Mn2+, một hem propionat và các chuỗi bên trong của Glu35, Glu39 và Asp 179. Quá trình phân giải lignin được xúc tác bởi MnP bao gồm các bước oxy hĩa và các bước khử. MnP liên kết H2O2 với enzym, sau đĩ oxy hĩa Mn2+
thành Mn3+ với sự cĩ mặt của chelat, và Mn3+
được tạo ra sau đĩ chuyển đổi các hợp chất phenolic lignin thành các gốc phenoxyl. Các chất chelat hĩa axit hữu cơ như oxalat và malonat cĩ thể ổn định Mn3+ và kích thích hoạt động của enzym. MnP cĩ thể thúc đẩy sự phân hủy lignin và sản lượng metan, 68,4% lignin từ chất thải rắn đơ thị đã được loại bỏ bởi MnP [50].
Từ những nghiên cứu riêng lẻ đối với từng loại enzym đến nghiên cứu tác động tổng hợp của cả ba loại enzym, nhiều nhà khoa học đều đưa ra kết luận chung là các enzym cellulase sẽ thay nhau phân hủy cellulose để tạo thành sản phẩm cuối cùng là glucose. Để phân hủy được cellulose, trước hết bề mặt cũng như các phần cấu trúc của cellulose cần phải được nới lỏng giúp các enzym cĩ thể xâm nhập và tiếp xúc trực tiếp với các sợi cellulose ở bên trong. Một khi các cellulase xâm nhập vào được mạng lưới cellulose sẽ từng bước tiến hành phân hủy cellulose để tạo thành sản phẩm cuối cùng là D-glucose. Sự thủy phân hồn tồn cellulose thành sản phẩm cuối cùng glucose cần cĩ hoạt động kết hợp của ít nhất 3 loại enzym endoglucanase (EC 3.2.1.4), exoglucanase (EC 3.2.1.74) và β-glucosidase (EC3.2.1.21) [52] (Hình 1.10).
Hình 1.10 Hoạt động của các enzym cellulase [51]
Sản phẩm phức hợp nhiều enzym hay thiết kế cellulosome là một trong những phương pháp được nghiên cứu gần đây để tối ưu hĩa quá trình thủy phân sinh khối. Thiết kế cellulosome bao gồm các vật liệu với CBM và rất nhiều các modul kết dính từ các hệ cellulase khác nhau được sinh tổng hợp từ nhiều lồi vi
So với các hệ thống enzym đơn chức năng, phức hợp cellulosome thể hiện sức mạnh tổng hợp giữa các phân tử một cách chặt chẽ. Khi đưa các đơn vị cấu thành xúc tác cĩ chức năng bất định vào liên kết vật lý chặt chẽ với nhau, hai enzym