Nhiệt độ tối ưu của enzym là nhiệt độ mà tại đĩ hoạt độ enzym đạt được cao nhất. Tiến hành xác định hoạt độ ở các nhiệt độ từ 30°C đến 90°C, kết quả thể hiện ở Hình 3.10.
Hình 3.10 Nhiệt độ tối ưu của CMCase thu nhận từ G4
Kết quả ảnh hưởng của nhiệt độ tới hoạt độ enzym cho thấy cellulase thu nhận từ G4 cĩ hoạt độ cao nhất ở 60oC. Hoạt độ CMCase ở 70 oC chỉ giảm khoảng 10% tuy nhiên ở 80 oC giảm mạnh và mất hồn tồn hoạt tính ở 90 oC. Nhiệt độ tối ưu của một số chủng Bacillus khác như CH4 và RH trong nghiên cứu của Mawada và cộng sư (2000) là 65°C và 70°C [113].
Nghiên cứu độ bền của enzym bởi nhiệt độ chúng tơi ủ enzym ở các nhiệt độ khác nhau trong 2 giờ. Kết quả xác định hoạt độ cịn lại của enzym so với ban đầu như hình 3.11.
Hình 3.11 Độ bền của enzym bởi nhiệt độ
Kết quả hình trên cho thấy cellulase từ vi khuẩn G4 cĩ hoạt tính ổn định khi bảo quản dưới 50ºC, với nhiệt độ 60ºC trở lên hoạt tính enzym giảm dần và giảm nhanh đến mất hoạt tính khi giữ ở nhiệt độ 70ºC trở lên, kết quả này cũng tương tự khi nghiên cứu độ bền bởi nhiệt độ của cellulase từ các Bacillus [99]. Tuy nhiên khi so sánh với một số chủng Bacillus cĩ khả năng chịu nhiệt thì độ bền nhiệt của G4 kém hơn. Như các chủng Bacillus trong nghiên cứu của Ekundayo và cộng sự thì các chủng này cĩ khả năng chịu được nhiệt độ đến 70ºC [74].
0 50 100 150 30 40 50 60 70 80 H o ạt độ CM Case cị n lại (% ) Nhiệt độ (°C)
trong 2 giờ, sau đĩ xác định hoạt tính cịn lại của enzym kết quả thu được ở Hình 3.12 và hình 3.13
Hình 3.12. pH tnh 3u c c cellulase th vi khuaseB.subtilis G4
Hình 3.13. Độ bền pH của chế phẩm cellulase từ B.subtilis G4
Các kết quả trên cho thấy cellulase thu nhận từ G4 cĩ hoạt tính cao nhất tại pH 7, tuy nhiên khoảng pH hoạt động tương đối rộng từ pH 4 tới pH 8, hoạt độ tại 4 và 8 đạt hơn 80% giá trị tối ưu.Hoạt độ giảm nhiều nhất tại pH 3 chỉ bằng 37% trong khi tại pH 9 vẫn đạt tới 67% giá trị tối ưu tại pH7.
Về độ bền của CMCase bởi pH cho thấy enzym bền với các trị pH từ 5-7 với các giá trị pH nhỏ hơn 5 hoạt tính enzym giảm nhanh, với các giá trị pH 8, 9 hoạt tính giảm chậm hơn. So sánh với một số nghiên cứu về giá trị pH hoạt động của các
Bacillus khác cũng cho kết quả tương tự [107][74]. Như vậy chế phẩm cellulase từ
B. subtilis G4 hoạt động tốt ở vùng pH từ 5-8.
3.3.3. Khả năng thủy phân của cellulase từ vi khuẩn G4 đối với các vật liệu giàu cellulose.
Khảo sát khả năng thủy phân lignocellulose của cellulase từ vi khuẩn G4 chúng tơi sử dụng dịch enzym thơ để thủy phân các cơ chất bã mía, rơm,và các cơ chất đã tiền xử lý bằng NaOH. 0 20 40 60 80 100 120 3 4 5 6 7 8 9 10 H o ạt độ CM Case cị n lại (% ) pH
Điều kiện thủy phân là các điều kiện tối ưu cho hoạt động của enzym: Nhiệt độ 60ºC, pH 7,0, nồng độ cơ chất 1% ml, nồng độ enzym 4,5U/ml. Xác định hàm lượng đường khử tạo thành sau 24 giờ thủy phân. Kết quả thu được ở Bảng 3.10
Bảng 3.10 Kết quả thủy phân lignocelluloses sử dụng enzym từ vi khuẩn G4
Cơ chất thủy phân Hàm lƣợng đƣờng khử tạo thành
Rơm 1,12±0,13 Bã mía 1,09±0,27 Rơm đã tiền xử lý bằng NaOH 1,78±0,21 Bã mĩa đã tiền xử lý bằng NaOH 1,49±0,15
Kết quả bảng trên cho thấy hàm lượng đường khử tạo thành sau thủy phân khơng cao dù sử dụng nồng độ enzym lớn trong dung dịch thủy phân (446U/g) hiệu quả quá trình thủy phân thấp, hiệu suất ước tính chỉ đạt từ 15%-30%.
Để biết được thành phần của dịch sau thủy phân chúng tơi tiếp tục phân tích hàm lượng glucose, xylose của dịch sau thủy phân, kết quả xác định thể hiện ở hình 3.14
Hình 3.14: Kình 3.14: c thành phần của dịch sau thủy phân
Kết quả kiểm tra sản phẩm thủy phân bằng HPLC cho thấy khơng cĩ sự tạo thành các sản phẩm đường của quá trình thủy phân như glucose, xylose điều này cho thấy hàm lượng đường khử đo được bằng DNS chủ yếu là các gốc khử của oligosacharid. Cĩ thể thấy được hệ cellulase của vi khuẩn G4 chủ yếu là endoglucanse, khơng cĩ hoặc cĩ rất ít các enzym khác trong hệ enzym thủy phân lignocellulose. Vì vậy enzym G4 chỉ phù hợp với quá trình thủy phân cellulose tinh khiết như CMC hoặc là nguồn enzym bổ sung để thiết kế hệ enzym Cellulosome.
3.4. Nghiên cứu cellulase từ vi khuẩn Cellulosimicrobium sp. MP1
3.4.1. Lựa chọn mơi trƣờng và điều kiện sinh tổng hợp cellulase từ MP1
3.4.1.1. Lựa chọn mơi trường sinh tổng hợp cellulase
Vi khuẩn MP1 được nuơi cấy trên các mơi trường LB, M1 M2 và M6 trong thời gian 48 giờ ở 37C, tốc độ lắc 100 vịng/phút, sau đĩ xác đinh hoạt tính CMCase trên các mơi trường tương ứng, kết quả thu được ở bảng sau
Bảng 3.11 Ảnh hưởng của mơi trường nuơi cấy tới khả năng sinh enzym
Mơi trƣờng Hoạt tính CMCase(U/ml)
LB 0,65± 0,11
M1 0,42± 0,17
M2 0,36± 0,21
M6 1,32± 0,15
Kết quả Bảng 3.13 cho thấy, cũng giống như vi khuẩn ruột mối G4, M6 cũng là mơi trường tốt nhất trong các mơi trường đã khảo sát đối với quá trình sinh enzym của chủng Cellulosimicrobium sp. MP1. Trên mơi trường M6 các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình sinh tổng hợp enzym như nhiệt độ, pH, tỷ lệ giống, tốc độ lắc cũng đã được nghiên cứu
3.4.1.2. Ảnh hưởng của các điều kiện kỹ thuật nuơi cấy tới sinh tổng hợp CMCase từ vi khuẩn MP1
Nhiệt độ là một yếu tố rất quan trong trong quá trình sinh trưởng và tổng hợp enzyme của vi sinh vật. Trong các bài báo, nghiên cứu trước đây, các chủng thuộc chi Cellulosimicrobium được xác định là những chủng ưa ấm với khả năng sinh sống trong khoảng nhiệt độ từ 20-40oC [114].
Với pH mơi trường các chủng thuộc chi Cellulosimicrobium cĩ thể sống, sinh trưởng và tổng hợp enzym trong một khoảng pH khá rộng (từ 6.0 đến 10.5) nhưng thường sinh các enzym cellulase, xylanase tốt hơn ở mơi trường kiềm yếu từ 7,5 đến 9. Vì vậy, khoảng pH được lựa chọn là từ 7 đến 11, nhiệt độ được chọn trong khoảng 25ºC đến 45ºC cho quá trình nghiên cứu
Hình 3.15 Ảnh hưởng các điều kiện kỹ thuật tới sinh tổng hợp enzym từ chủng MP1
Kết quả nghiên cứu các điều kiện thích hợp cho quá trình sinh tổng hợp cellulase của vi khuẩn MP1 cho thấy, vi khuẩn MP1 sinh CMCase tốt nhất trên mơi trường M6 ở 37ºC, pH 7,5, tỷ lệ giống 5% và tốc độ lắc 100 vịng/phút, các điều kiện này cũng giống với điều kiện sinh enzym của chủng vi khuẩn
Cellulosimicrobium cellulans được phân lập từ mẫu tảo đỏ [115]. Với kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ tới sinh tổng hợp enzym cho thấy MP1 sinh CMCase tốt nhất ở 37 oC. Kết quả thu được cĩ sự tương đồng với kết quả được cơng bố bởi Naami và cs, khi Cellulosimicrobium sinh trưởng tốt nhất ở nhiệt độ 29oC nhưng lại sinh enzym amylase tốt nhất ở 35oC [116]. Một số nghiên cứu khác cũng đã sử dụng nhiệt độ 37oC để nuơi cấy các chủng Cellulosimicrobium phục vụ mục đích thu một số loại enzym xylanase và mannanase [102][12].
Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH của mơi trường nuơi cấy cho thấy pH trong khoảng 7,0-10 là pH phù hợp cho quá trình sinh enzym đối với chủng MP1. Kết quả này cho thấy rằng chủng Cellulosimicrobium sp. MP1 là một chủng chịu kiềm, khi pH mơi trường ban đầu tăng trong khoảng từ pH 7 đến pH 10 thì hoạt độ CMCase giảm khơng đáng kể. Kết quả này cũng giống với cơng bố của Liu và cộng sự khi nghiên cứu chủng C.cellulans L804 phân lập từ đất sinh trưởng tốt nhất ở pH 7,0 và chỉ giảm mạnh ở pH 10,5 [12].
Thời gian là một trong các yếu tố quan trọng cho quá trình sinh enzym của vi khuẩn. Nghiên cứu yếu tố thời gian để xác định được thời điểm thu nhận enzym từ vi khuẩn.
Hình 3.16 Ảnh hưởng của thời gian nuơi cấy đến hoạt độ CMCase của Cellulosimicrobium sp. MP1
Cũng tương tự như chủng vi khuẩn Bacillus subtilis G4 chủng
Cellulosimicrobium sp. MP1 cũng cĩ thời gian thích hợp nhất cho quá trình thu nhận enzym là 72 giờ.
3.4.2. Ảnh hƣởng các nguồn dinh dƣỡng tới quá trình sinh tổng hợp CMCase
3.4.2.1. Ảnh hưởng nguồn nitơ
Thay thế nguồn nitơ bởi cao nấm men, casein và NaNO3 bởi nguồn nitơ vơ cơ NH4Cl, NH4NO3. Kết quả xác định hoạt độ được thể hiện trên Bảng 3.12, hoạt độ của enzym trên các mơi trường chứa nguồn nitơ khác nhau. Kết quả thu được như bảng sau
Bảng 3.12 Ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng N tới khả năng sinh enzym của chủng MP1
Nguồn Nitơ Hoạt tính CMCase(U/ml)
Peptone 1% 0,84± 0,1 Casein 1% 2,89± 0,18 Casein 0,5% 1,05 ± 0,15 NH4NO3 1% 0,15± 0,11 Cao nấm men 1% 0,99± 0,17 0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 24h 48h 72h 96h H o ạt độ CM Case (U/m l)
nấm men cho chủng phát triển tốt trong khi NaNO3 làm cho chủng phát triển chậm và hoạt chất sinh học thu được thấp.
3.4.2.2. Ảnh hưởng nguồn dinh dưỡng cacbon
Các nguồn cacbon khác nhau được sử dụng lần lượt trong mơi trường M6. Kết quả xác định hoạt độ enzym trên các mơi trường cĩ nguồn cacbon tương ứng thu được số liệu như bảng sau:
Bảng 3.13 Ảnh hưởng nguồn cacbon tới khả năng sinh enzym của chủng MP1
Nguồn Cacbon Hoạt tính CMCase(U/ml)
Glucose1% 0,84± 0,1 Cám gạo 1% 1,89± 0,18 Cám gạo 2% 1,05 ± 0,15 Tinh bột 1% 3,15± 0,11 Tinh bột 2% 0,99± 0,17 Tinh bột 2,5% 0,08± 0,13
Kết quả trên cho thấy tinh bột 1% là nguồn cacbon tốt nhất cho quá trình sinh tổng hợp cellulase của chủng vi khuẩn MP1. Như vậy, cũng giống với chủng G4, với nguồn cacbon tinh bột hoạt tính CMCase tăng cao nhất so với các nguồn cacbon khác.
3.4.2.3. Ảnh hưởng của hàm lượng bột đậu tương tới quá trình sinh cellulase
Ảnh hưởng của bột đậu tương đã được khảo sát với kết quả thu được như sau:
Bảng 3.14 Ảnh hưởng nồng độ bột đậu tương tới khả năng sinh enzym của chủng MP1
Nồngđộ bột đậu tƣơng (%) Hoạt tính CMCase(U/ml) 0 0,84± 0,1 0,5 1,89± 0,18 1,0 1,05 ± 0,15 1,5 3,25± 0,11 2.0 0,92 ± 0,15
Kết quả trên cho thấy với nồng độ 1.5% bột đậu tương trong mơi trường thu được CMCase cĩ hoạt tính cao nhất.
Quá trình nghiên cứu ảnh hưởng của các điều kiện lên men và ảnh hưởng của các nguồn dinh dưỡng trong mơi trường nuơi cấy đã tìm được điều kiện phù hợp cho quá trình sinh cellulase từ chủng vi khuẩn MP1.
Vi khuẩn MP1 được nuơi trên mơi trường cĩ nồng độ tinh bột 1%, casein 1%, bột đậu tương 1,5 % với các điều kiện nhiệt độ 37ºC, thời gian nuơi cấy 72h, tỷ lệ giống 5%, tốc độ lắc 100 vịng/phút, pH mơi trường 7,5 là mơi trường phù hợp cho quá trình sinh cellulase. Hoạt độ CMCase đạt cao nhất là 3,25 U/ml. Đây là mơi trường được lựa chọn để thu nhận enzym cho các nghiên cứu khảo sát khả năng thủy phân của enzym từ MP1.
3.4.3. Đặc tính cellulase tạo thành bởi Cellulosimicrobium sp.MP1
3.4.3.1. Thu nhận chế phẩm cellulase bằng kết tủa bởi ethanol
Lựa chọn 3 dung mơi là (NH4)2SO4, acetone, ethanol để kết tủa thu nhận chế phẩm enzym, kết quả cho thấy với dung mơi ethanol cho hiệu suất thu hồi cao
nhất. Kết quả kết tủa enzym bằng ethanol thể hiện bảng 3.15
Bảng 3.15 Thơng số enzym từ MP1 sau kết tủa bằng ethanol
Nồng độ dung mơi V dich (mL) CMCase (U/mL) Protein (mg/mL) Hoạt độ riêng (U/mg) Hiệu suất thu hồi (%) Độ tinh sạch Enzym thơ 100 3,12 0,023 1,36 100 1 20% 10 1,60 0,03 5,25 5,13 3,85 40% 10 2,03 0,05 3,88 6,50 2,85 60% 10 9,71 0,13 7,58 31,14 5,56 80% 10 9,80 0,18 5,46 31,43 4,00
Kết quả bảng 3.15 cho thấy khi nồng độ ethanol càng cao, lượng protein kết tủa thu được càng nhiều và đạt cao nhất ở nồng độ cồn 80% với hiệu suất thu hồi theo protein đạt 31,43%. Tuy hiệu suất thu hồi enzym đạt cao nhất tại nồng độ cồn
3.4.3.2. Xác định đặc tính chế phẩm cellulase thu từ Cellulosimicrobium sp. MP1
Nhiệt độ và pH tối ƣu
Protein enzym sau khi kết tủa tại nồng độ cồn 60% v/v được hịa tan trong các dung dịch đệm cĩ pH khác nhau.
Hình 3.17. Ảnh hưởng của pH đến hoạt độ của enzyme CMCase từ MP1
Kết quả cho thấy khoảng pH hoạt động hiệu quả của enzym kết tủa từ dịch lên men của chủng Cellulosimicrobium sp. MP1 là tương đối rộng từ 5-10. Trong đĩ ở pH 6 hoạt độ CMCase đo được là lớn nhất, đạt 0,23 ± 0,003 U/ml. Kết quả này phù hợp với một số báo cáo kết luận pH hoạt động tối ưu của cellulase từ
Cellulosimicrobium là 5-6 [117][118].
So với nghiên cứu tách cellulases kiềm tính từ Bacillus subtilis của Deepmoni Deka (trong đĩ, hoạt độ CMCase đạt tối ưu ở pH 9, nhưng hoạt tính chỉ đạt 70% ở các pH 8 và 10), enzym cellulase từ Cellulosimicrobium sp. MP1 cĩ khoảng pH hoạt động tối ưu rộng hơn, tại pH 10 hoạt độ vẫn đạt gần 90% so với pH tối ưu. Đây là một đặc điểm đáng chú ý cĩ tiềm năng ứng dụng của enzym CMCase thu từ chủng Cellulosimicrobium sp. MP1.
Protein enzym sau khi kết tủa được hịa tan trong đệm Na-phosphate pH 6,0 pha lỗng thích hợp và thực hiện phản ứng với cơ chất CMC (hịa tan trong đệm tương ứng) ở các nhiệt độ khác nhau.
Hình 3.18. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính CMCase từ MP1
Kết quả cho thấy hoạt độ CMCase cao nhất ở 600C, cao hơn nhiệt độ 500
C trong cơng bố của Jian-Min Song và cơng sự khi nghiên cứu cellulases từ
C.cellulans [118]. Ở nhiệt độ 700C, hoạt độ enzym CMCase giảm 20% so với hoạt độ xác định ở nhiệt độ tối ưu.
Độ bền nhiệt và bền pH
Kết quả Hình 3.19 cho thấy ở pH axit bằng 4, hoạt tính enzym giảm mạnh cịn 20% sau 20h. Tuy nhiên, từ khoảng pH 5, độ bền hoạt độ enzyme duy trì tương đối ổn định từ 70-80%.
Hình 3.19. Độ bền pH của chế phẩm cellulase từ MP1
Trong nghiên cứu của Jian-Min Song và cộng sự, hoạt tính CMCase thu từ
C.cellulans giảm mạnh cịn 18% sau 6 giờ ở pH axit 3 và 4. Kết luận này tương đối phù hợp với kết quả thí nghiệm thể hiện trong Hình 3.19. Tuy nhiên, ở các giá trị pH khác, hoạt tính cellulase của chủng MP1 duy trì ổn định tốt hơn so với nghiên
Kết quả Hình 3.20 cho thấy ở nhiệt độ càng cao, sự suy giảm hoạt tính diễn ra càng nhanh và càng sớm ngay ở những giờ đầu tiên. Sau 2 giờ, hoạt tính CMCase ở nhiệt độ 40°C và 50°C giảm khơng đáng kể cịn hơn 90%. Hoạt tính CMCase tương đối cịn 70% ở nhiệt độ 60°C và giảm mạnh cịn 30% ở nhiệt độ 70°C sau 2 giờ. Khi kéo dài đến 4giờ, hoạt độ của enzym ủ ở các nhiệt độ 40, 50, 60°C giảm cịn 40-43% trong khi hoạt độ chỉ cịn 10% ở 70°C. Trong nghiên cứu về độ bền nhiệt của cellulases thu từ C. cellulans của Jian-Min Song và cộng sự, ở nhiệt độ 45°C, cellulase cịn giữ được 55,68% hoạt tính sau 6h cịn ở nhiệt độ 600C hoạt độ enzym giảm mạnh đến 75-90% . Đối với chủng MP1, hoạt độ CMCase cũng giảm tương tự đến 60% sau 4h ở 600C.
Hình 3.20. Độ bền nhiệt chế phẩm cellulase từ MP1
3.4.3.3. So sánh đặc tính enzym từ B. subtilis G4 và Cellulosimicrobium sp. MP1
Bảng 3.16. So sánh đặc tính enzyme từ B. subtilis G4 và Cellulosimicrobium sp. MP1
Thơng số B. subtilis G4 Cellulosimicrobium
sp. MP1 Enzym thơ Hoạt độ CMCase tối ưu 5,59± 0,11 3,25± 0,13 Hoạt độ FPU 0,113 ± 0,005 0,325± 0,10 Hoạt độ xylanase 0,170± 0,006 1,14±0,06 Chê phẩm cellulase pH tối ưu 7.0 6.0 Bền pH 5-8 5-10
Nhiệt độ tối ưu (°C) 60 60
Bền nhiệt (°C) 40-50 40-50
Mặc dù enzym thơ từ B. subtilis G4 cĩ hoạt độ CMCase cao hơn từ