(Random Amplified Polymorphic DNA)
RAPD được định nghĩa là sự đa hình các đoạn DNA được khuếch đại ngẫu nhiên. PCR-RAPD thực hiện dựa trên cơ sở sự bắt cặp ngẫu nhiên của các primer đơn ngắn (10 nucleotide) với mạch khuôn. Các đoạn primer oligonucleotide nếu bắt cặp ngẫu nhiên với cả hai mạch đối diện của mạch khuôn DNA trong khoảng cách có thể khuếch đại được (dưới 3000 bp) sẽ cho ra những đoạn DNA có kích thước khác nhau sau khi khuyếch đại.
Sự có mặt của các sản phẩm DNA khác nhau chứng tỏ đã có một sự tương đồng hoàn toàn hay một phần giữa DNA bộ gen và primer. Các primer dùng trong RAPD thường ngắn vì vậy dễ dàng tìm được các đoạn tương đồng trên mạch đơn DNA bộ gen. Do đó tính đa dạng thu được nhờ RAPD là đáng tin cậy, vì khi có sự thay đổi một base nito nào đó thì nó sẽ ngăn cản việc tiếp hợp giữa primer và DNA mạch khuôn. Sự mất đoạn nhiễm sắc thể hoặc sự thêm bớt điểm gắn primer cũng như sự xen vào của một gen nào đó sẽ làm thay đổi kích thước đoạn DNA được khuếch đại.
Nguyên tắc phản ứng RAPD cũng như nguyên tắc phản ứng PCR thông thường. Tuy nhiên, vì sử dụng primer ngẫu nhiên nên nhiệt độ bắt cặp của primer thấp để tạo điều kiện bắt cặp không nghiêm ngặt. Nhiệt độ bắt cặp của phản ứng là 30 - 36oC. Chính vì yếu tố đặc hiệu thấp nên kết quả RAPD thường có độ lặp lại không cao và
khó tối ưu phản ứng. Ðây chính là trở ngại lớn nhất của RAPD vì kết quả phụ thuộc rất nhiều yếu tố như thành phần phản ứng PCR (đặc biệt là thành phần Mg2+ và chất lượng DNA bản mẫu), các thiết bị cũng như thao tác thí nghiệm.
Ngoài ra RAPD là một marker trội do đó những gen điều khiển tính trạng lặn sẽ khó tìm thấy sự đa hình trong điện di.
2.3.4.Các kết quả sử dụng kỹ thuật RAPD để nghiên cứu về sự đa dạng di truyền thực vật
Kỹ thuật RAPD hiện nay đã và đang được ứng dụng rộng rãi trong nghiên cứu và xác định quan hệ di truyền ở thực vật như lúa [26], khoai tây [40], cà chua [2],…Kỹ thuật RAPD cũng được ứng dụng trong việc đánh giá đa dạng di truyền giữa các loài và trong phạm vi một loài phân tích, đánh giá hệ gen thực vật nhằm xác định những thay đổi của các dòng chọn lọc ở mức phân tử [80], [81].
Phương pháp này còn được ứng dụng trong việc đánh giá bộ gen của giống và khả năng phân tích mối quan hệ di truyền giữa các loài, nhóm các cá thể cùng một loài [18].
Subramanian và cs (2002) đã nghiên cứu tính đa hình DNA ở cây lạc nhờ kỹ thuật RAPD. Nhóm tác giả đã sử dụng 48 mồi ngẫu nhiên và xác định được 7 mồi (14,6%) đa hình. Tổng số phân đoạn DNA được tạo ra từ 7 mồi đó là 408 phân đoạn, trong đó có 27 phân đoạn thể hiện tính đa hình [100].
Paulo (2004) đã xác định mối quan hệ di truyền của 81 giống ngô (Zea mays) ở phía Nam Brazil nhờ chỉ thị RAPD. Trong nghiên cứu này, tác giả sử dụng 32 mồi ngẫu nhiên và kết quả thu được 225 phân đoạn, trong đó có 184 phân đoạn thể hiện tính đa hình (chiếm 72,2%). Từ kết quả này, cây phả hệ được thành lập bằng cách sử dụng phần mềm UPGMA. Kết quả nghiên cứu này sẽ được sử dụng để chứng minh và duy trì nguồn gen từ ngô [85].
Đinh Thị Phòng và cs (2008) sử dụng 19 giống đậu tương từ tập đoàn giống đậu tương của Viện Nghiên cứu dầu và Cây có dầu Việt Nam nhằm nghiên cứu khoảng cách di truyền để xác định vật liệu trong chọn tạo giống mới. Các tác giả sử dụng 25 mồi RAPD, trong đó có 17 mồi cho tính đa hình [23].
Theo Hoàng Thị Thao (2010) bằng kỹ thuật RAPD với việc sử dụng 10 mồi ngẫu nhiên đã nhận được 1.208 phân đoạn DNA được nhân bản ngẫu nhiên từ hệ gen của 30 giống đậu xanh. Trong 10 mồi ngẫu nhiên sử dụng thì cả 10 mồi đều biểu hiện tính đa hình. Kết quả phân tích cho thấy, 30 giống đậu xanh nghiên cứu chia thành 2 nhóm chính, hệ số tương đồng di truyền giữa 2 nhóm là 67% (tức sai khác 33%) [29].
Nisha và cs (2011) đã sử dụng các chỉ thị đa hình RAPD để đánh giá đa dạng di truyền 10 giống rau mùi Ấn Độ (Coriandrum sativum). Kết quả cho thấy: Tổng cộng có 74 phân đoạn sáng rõ xuất hiện, trong đó có 43,2% là đa hình. Số phân đoạn đa hình
xuất hiện ở mỗi mồi thay đổi từ 1 đến 11 phân đoạn, khuếch đại từ 370 bp đến 14.860 bp. Hệ số tương đồng di truyền cao dao động giữa các giống từ 0,7 đến 0,95 [82].
Hatsadong Chanthanousone (2016) đã sử dụng 21 mồi RAPD biểu hiện đa hình để xác định mối quan hệ di truyền của 35 chủng vi khuẩn R. solanacearum thu thập từ các ruộng trồng cà chua, bí đao, cà pháo, dưa chuột, ớt ở các tỉnh phía Bắc Việt Nam. Kết quả cho thấy giữa các chủng vi khuẩn có sự đa dạng di truyền cao thể hiện qua số phân đoạn DNA trung bình/mồi là 85,5 và có mức độ tương đồng dao động chủ yếu từ 0,55 - 0,80 đồng thời kết quả phân tích cũng cho thấy các chủng vi khuẩn được thu thập trên cùng một đối tượng kí chủ có sự khác biệt di truyền cao hơn so với các chủng vi khuẩn ở các vùng sinh thái khác nhau [2].
Khiếm Thực (Euryale ferox Salisbury) là một loài thực vật thủy sinh quan trọng trong trồng trọt ở đông Ấn Độ. Trong nghiên cứu đánh giá đa dạng di truyền của 16 giống Khiếm Thực có trong quỹ gen, Hemant và cs (2016) đã sử dụng 40 mồi RAPD. Khuếch đại sản phẩm PCR-RAPD cho 553 phân đoạn đa hình với trung bình 13,32 phân đoạn trên mỗi mồi, tỷ lệ đa hình dao động từ 37,5 đến 100, với trung bình là 88,3%. Hệ số tương đồng di truyền dao động từ 0,45 đến 0,69. Kết quả này rất cần thiết cho việc bảo tồn và nhân giống cây Khiếm Thực tại Ấn Độ [65].
Thu thập 92 giống đậu tương từ 5 nguồn khác nhau (Pakistan, Hoa Kỳ, Trung tâm Rau thế giới, Nhật Bản, Bắc Triều Tiên), Muhammad và cs (2016) đã sử dụng 10 mồi đa hình RAPD trong tổng số 20 mồi thử nghiệm. Có 107 phân đoạn đa hình được khuếch đại với trung bình 10,7 phân đoạn trên mỗi mồi. Pakistan và Hoa kỳ có số lượng phân đoạn đa hình nhiều nhất (95%), trong khi Bắc Triều Tiên có tỷ lệ các phân đoạn đa hình thấp nhất (60%). Kết quả phân tích kiểu gen được chia thành 5 nhóm chính bao gồm 13 nhóm nhỏ. Phân tích đa dạng di truyền cho thấy các giống đậu tương từ Pakistan, Hoa Kỳ và Trung tâm rau Thế giới có sự đa dạng kiểu gen nhiều hơn so với các giống từ Bắc Triều Tiên và Nhật Bản [78].
Phạm Hà Thanh Tùng và cs (2015) đã nghiên cứu đa dạng di truyền của chi
Gymnema R. Br. ở Việt Nam bằng kỹ thuật RAPD - PCR. Đối tượng nghiên cứu: 20 mẫu thuộc chi Gymnema R.Br. Các mẫu được thu tại các địa điểm khác nhau trong phạm vi lãnh thổ Việt Nam và được xử lý theo quy trình xử lý mẫu tiêu bản và lưu trữ tại phòng tiêu bản Trường Đại học Dược Hà Nội. Kết quả PCR với 30 mồi ngẫu nhiên cho hệ số đa hình trung bình của 15 mồi đa hình với tỷ lệ băng ADN đa hình là 70,7%. Với chỉ thị RAPD-PCR đã chia 20 mẫu Gymnema Việt Nam ra 4 nhóm tương ứng với 4 loài Gymnema dựa trên phân loại hình thái. Ngoài ra, mỗi loài được tách thành các nhóm phụ có độ tương đồng di truyền trên 75%. Những kết quả này là bước đi đầu tiên trong việc xây dựng cơ sở dữ liệu phân tử phục vụ cho bảo tồn gen các loài thuộc chi Gymnema R.Br ở Việt Nam [33].
Trần Duy Cường và cs (2014) nghiên cứu đa dạng di truyền nguồn gen cây Húng, xác định mối quan hệ di truyền giữa Húng Láng với các giống/loài Húng khác nhau bằng kỹ thuật PCR-RAPD. Nghiên cứu đã sử dụng 15 mồi ngẫu nhiên RAPD, thu được tổng cộng 2.435 băng, thuộc 106 loại băng có kích cỡ khác nhau, trong đó có 47 loại băng đa hình (44,3%) và 59 loại băng đơn hình (55,7%). Hệ số tương đồng di truyền trong số 32 giống nghiên cứu dao động từ 0,72 đến 1. Trong đó, 11 giống Húng Láng được thu thập tại các địa điểm khác nhau có các biến thể di truyền gần nhau (dao động từ 0,00 đến 0,11). Tại hệ số tương đồng di truyền 80%, có 32 giống đã được chia thành 5 nhóm khác nhau. Dựa trên kết quả của các phân nhóm di truyền, 11 giống Húng Láng đã được lựa chọn giải trình tự gen để xác định các marker phân tử nhận dạng và đăng ký trên ngân hàng gen thế giới nhằm mục đích nghiên cứu, đánh giá đa dạng về di truyền nguồn gen cây Húng phục vụ công tác bảo tồn, khai thác và sử dụng bền vững nguồn gen cây rau bản địa quý này [6].
Vũ Thị Thu Hiền và Đinh Thị Phòng (2011) Ứng dụng kĩ thuật DNA vào việc đánh giá mối quan hệ di truyền tập đoàn cây gỗ Trắc đỏ (Dalbergia Cochinchinensis) ở Việt Nam đang có nguy cơ tuyệt chủng. Dalbergia Cochinchinensis là loài cây gỗ quý hiếm có nguy cơ bị đe doạ tuyệt chủng do kinh tế và thương mại có giá trị cao. Các kỹ thuật RAPD và ISSR đã được sử dụng để nghiên cứu mối quan hệ di truyền của 35 mẫu DNA lấy từ Vườn Quốc gia JokDon (tỉnh Đắk Lắk) và Kbang (Gia Lai). Tổng cộng có 51 mồi được sử dụng (23 ISSR và 28 RAPD), có 31/51 mồi cho thấy đa hình với giá trị PIC khác nhau từ 0 (IS8, OPD03, ...) đến 0,423 (P63). Trong số 163 mảnh đã được khuếch đại, trong đó 99 là đa hình (chiếm 60,74%). Các hệ số tương tự di truyền giữa 35 mẫu D. cochinchinensis dao động từ 0.655 (Dc5 và Dc30) đến 0.942 (Dc10 và Dc11). Mô hình nhóm trong chương trình giống dendrogram chia ra 35 mẫu D.cochinchinensis thành 2 nhóm chính và có hệ số biến dị di truyền khoảng 5,1% (1 - 0,949) đến 29,3% (1 - 0,707). Nhóm đầu tiên bao gồm mẫu Dc9 duy nhất có hệ số biến dị di truyền khoảng 29,3% (1 - 0,707). Nhóm thứ hai gồm 34 mẫu còn lại với hệ số biến dị di truyền khoảng 5,1% (1 - 0,949) đến 26,0% (1 - 0,740) [13].
Nguyễn Thị Ngọc Trâm (2016) nghiên cứu đa hình di truyền tập đoàn các giống rau sam (Portulaca oleracea L.) có ở Việt Nam bằng kỹ thuật RAPD. Kết quả thực hiện 44 phản ứng PCR - RAPD với 11 mồi ngẫu nhiên trên 4 mẫu rau sam thu được tổng số 223 băng, thuộc 61 loại băng có kích cỡ khác nhau. Trong đó 15 băng cho đa hình, chiếm 24,59 % và 46 băng đơn hình chiếm 75,41 %. Từ đó, đã thiết lập được bảng hệ số tương đồng di truyền và sơ đồ cây phát sinh chủng loại về mối quan hệ di truyền của các mẫu rau sam. Hệ số di truyền giữa các mẫu nghiên cứu dao động từ 0,76 đến 1. Ở mức tương đồng khoảng 76%. Nghiên cứu này đã xác định được cây rau sam RS01 có thân màu tím là cây thuốc được nhân dân sử dụng hàng trăm năm nay, không có độc tính, tốt cho người sử dụng, phục vụ cho mục đích chọn giống, khai thác và phát triển nguồn gen cây rau sam tại vùng trồng Long Thành tỉnh Đồng Nai [37].
Nguyễn Thúy Hạnh và Nguyễn Đức Thành (2006) kết quả phân tích đa dạng di truyền loài sao lá hình tim (Hopea Cordata vidal) thuộc họ dầu (Dipterocarpaceae) bằng chỉ thị phân tử. Kết quả phân tích một số gen lục lạp và chỉ thị nhân (RAPD) cho thấy về mặt tiến hóa, các mẫu Sao lá hình tim có cùng nguồn gốc vì không tìm thấy sự đa hình các gen lục lạp đã nghiên cứu. Có sự khác biệt nhỏ trong bộ gen nhân mà nguyên nhân có thể là có thể do biến đổi của các tính trạng thích nghi lên điều kiện sinh thái của từng vùng cụ thể. Cần phải bảo vệ 3 quần thể cuối cùng của loài để duy trì càng nhiều gen càng tốt cho sự tồn tại của loài trong tương lai. Mặt khác cần sớm thu hái hạt giống từ cả 3 vùng trong một số năm để gieo ươm, gây trồng bảo tồn loài ở nơi có điều kiện bảo vệ tốt nhất [12].
Nguyễn Thị Pha và cs (2012) đa dạng sinh học một số loài Lan rừng thuộc chi
Dendrobium bằng kỹ thuật RAPD. Kết quả phân tích 12 mẫu của 9 loài lan rừng Dendrobium và 2 loài lan lai bằng kỹ thuật RAPD cho thấy 10 primer đều thể hiện tính đa hình cao và ghi nhận được 214 dấu phân tử. Mười hai mẫu của 11 loài lan được phân nhóm di truyền thành 3 nhóm chính, trong đó nhóm A lớn nhất gồm 7 loài, nhóm B nhỏ nhất là 1 loài. Mức độ tương đồng trong khoảng 58 - 95%, nhóm C gồm 4 mẫu của 3 loài lan rừng có tương quan di truyền cao nhất đạt 80%. Hai mẫu lan của loài D. crumenatum Sw. là Hoàng thảo tuyết mai lá mỏng và Hoàng thảo tuyết mai lá dày có kiểu hình gần giống nhau, tuy nhiên khoảng tương đồng của chúng chỉ đạt 84%. Mẫu lan Hoàng thảo tuyết mai lá dày và loài Hoàng thảo nhất điểm hồng tuy có đặc điểm hình thái khác nhau nhưng lại có hệ số tương quan di truyền cao nhất đạt gần 95% [22].
Nguyễn Hạnh Hoa và cs (2014) Ðánh giá đa dạng di truyền một số dòng, giống hoa chi Lan Huệ (Hippeastrum herb.) bằng chỉ thị phân tử RAPD. Kết quả phân tích đa dạng nguồn gen ở mức phân tử của 10 giống/loài chi Lan Huệ (Hippeastrum Herb.). 15 chỉ thị RAPD được sử dụng trong phản ứng PCR với các mẫu nghiên cứu cho 594 phân đoạn, trong đó có 504 phân đoạn đa hình, đạt tỷ lệ 84,4%. Số liệu nhị phân các phân đoạn ADN được xử lý bằng phần mềm NTSYS 2.02h. Kết quả phân tích cho thấy hệ số đa dạng di truyền (PIC) thu được của các mồi khá cao đạt từ 0,6928 đến 0,8587, trung bình đạt 0,806. Phân tích số liệu thu được cũng cho thấy sự đa dạng lớn trong tập đoàn nguồn gen đã thu thập, với hệ số tương đồng di truyền từ 0,2 đến 0,76. Những kết quả này bước đầu cung cấp những dẫn liệu cần thiết phục vụ cho công tác chọn tạo giống mới chi Lan Huệ [15].
Nguyễn Xuân Tùng và cs ( 2012) đã phân tích di truyền 6 dòng chuối tiêu thương phẩm tại Lâm Đồng dùng kỹ thuật RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA – đa hình các đoạn ADN khuếch đại ngẫu nhiên) cho thấy hệ số di truyền gần giống nhau và giống với chuối Tiêu hồng lấy ở Viện cây ăn quả, Hà Nội (trên 85%) nhưng lại khác với chuối Già Đài Loan tại đại phương. So sánh đoạn trnF-trnL trong lục lạp giữa
các dòng chuối tiêu khảo sát chỉ khác nhau khoảng 5 vị trí (<2%) chứng tỏ chúng có chung một nguồn gốc. Giống chuối Laba trung, thân tím đen hoàn toàn tương đồng với các giống chuối Cavendish phổ biến ở vùng Đông Nam Á như giống Siamea (Thái Lan), Burmanicoides (Myanmar), Malaccensis (Malaysia), chứng tỏ chuối Laba không phải loài đặc hữu mà có thể được di thực vào Lâm Đồng [34]
Nguyễn Lộc Hiền, Huỳnh Kỳ và Tadashi Yoshihashi (2010) để làm cơ sở cho việc tuyển chọn giống đậu nành rau thích nghi với điều kiện đồng bằng sông Cửu Long, nghiên cứu đánh giá sự đa dạng di truyền của 22 giống đậu nành rau Nhật Bản dựa trên 15 tính trạng hình thái - nông học, 40 primer RAPD và 26 primer SSR đã được thực hiện. Có 62,85% đặc điểm hình thái - nông học được mô tả là đa hình. So với dấu hình thái, dấu RAPD và SSR đã chỉ ra mức độ khác biệt cao hơn và hiệu quả trong phân tích đa dạng di truyền: dấu RAPD với 70,32% đa hình và 94% dấu SSR là đa hình. Phân tích nhóm dựa trên 3 loại marker này đã phân 22 giống nghiên cứu thành 4 nhóm với khoảng cách Euclidean là 4,47-10,05. Mức độ đa dạng di truyền cho thấy sự khác biệt giữa các giống đủ để sử dụng cho việc chọn tạo giống mới. Bốn giống Wase edamame, Fusanari chamame, Chuse edamame và Yuusuzumi có quan hệ xa về mặt di truyền so với các giống khác và đây là nguồn vật liệu lai tạo quan trọng cho tương lai.. [14].
Nguyễn Đức Thành và Nguyễn Thúy Hạnh (2005) kết quả nghiên cứu các loài cây họ Dầu được nghiên cứu có mức độ đa dạng về mặt di truyền cao, hệ số di truyền