Kết quả của chỉ thị phân tử RAPD phụ thuộc rất nhiều yếu tố như nồng độ Tag polymerase, Mg2+, dNTP, chất lượng DNA, nhiệt độ bắt mồi [23]. Vì vậy việc tối ưu nồng độ phản ứng của MgCl2 (25 Mm) và dNTP (10 Mm) sẽ đạt kết quả cao.
Tiến hành bố trí thí nghiệm 9 công thức (CT) như Sơ đồ 4.1, sử dụng giống ĐC và giống Philippin. MgCl2 (25 Mm) dNTP(10 Mm) 0,5(µl) 1,0(µl) 1,5(µl) 0,5 (µl) CT1 CT4 CT7 1,0 (µl) CT2 CT5 CT8 1,5 (µl) CT3 CT6 CT9
Sơ đồ 4.1. Thí nghiệm so sánh ảnh hưởng của nồng độ MgCl2 và dNPT trong phản ứng RAPD
Kết quả thu được như Hình 4.2 khi thực hiện phản ứng RAPD với các nồng độ MgCl2 và dNTP khác nhau, nhận thấy ở CT1, CT5, CT8 xuất hiện 5 phân đoạn DNA; CT4, CT7, CT9 xuất hiện 3 phân đoạn DNA; CT2, CT6 chỉ xuất hiện 1 phân đoạn DNA và ở CT3 không xuất hiện phân đoạn nào.
Như vậy CT1, CT5, CT8 xuất hiện các phân đoạn DNA đa hình ở 2 giống Địa phương và Philippin
Hình 4.2. Kết quả kiểm tra sản phẩm PCR-RAPD với các nồng độ MgCl2
và dNTP khác nhau..
[M: 100 bp DNA ladder, I:CT1, II:CT2, III:CT3, IV:CT4, V:CT5, VI:CT6, VII:CT7, VIII:CT8, IX:CT9][1: Địa phương, 2: Philippin]
Dựa vào kết quả xuất hiện nhiều phân đoạn DNA nhất trên hai giống ĐC và Philippin, chúng tôi tiến hành kiểm chứng CT1, CT5, CT8 trên lần lượt 5 giống đại diện là: ĐC, VI047492, Thái Lan, PKM-1 và Philippin cho mỗi công thức. Kết quả thu được như Hình 4.3.
Hình 4.3. Kết quả điện di sản phẩm PCR-RAPD sử dụng CT1, CT5, CT8
[I: CT1, VI: CT5, VIII: CT8][1: ĐC, 2: VI047492, 3: Thái Lan,4: PKM-1, 5: Philippin] Mũi tên chỉ các đoạn DNA đa hình đại diện
Hình 4.3 cho thấy, ở công thức I có sự xuất hiện các phân đoạn DNA đa hình, rõ nét trong khi công thức V và công thức VIII không xuất hiện. Kết quả trên cũng cho thấy, nồng độ MgCl2 và dNTP là một trong những yếu tố quan trọng quyết định sự biểu hiện của các mồi đa hình.
Tiến hành các phản ứng PCR-RAPD tiếp theo chúng tôi sử dụng nồng độ MgCl2
và dNTP như công thức I, các thành phần tham gia mỗi phản ứng gồm 15 µl, trong đó: Nước cất vô trùng: 4,8 µl; 5X buffer: 3 µl; MgCl2 (25Mm): 0,5 µl; dNTP (10Mm): 0,5 µl; primer: 1 µl; Taq polymerase: 0,2 µl và DNA: 5 µl.