CHƢƠNG I : TỔNG QUAN VỀ CÁC NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
1.5. Axit béo của san hô
1.5.2. Thành phần axit béo của lipit phân cực
Lipit là thành phần cấu tạo chính của mơ tế bào, các axit béo trong lipit phân cực phụ thuộc nhiều vào lồi của cá thể hơn trong lipit khơng phân cực (lipit trung tính). Lipit phân cực của san hơ kín Stylophora istillata tại độ sâu từ 3 đến 35 m về giá trị hầu nhƣ khác nhau theo mức độ không no và t lệ axit các dãy (n-3), (n-6)
22, tuy nhiên khi độ sâu tăng lên thì hàm lƣợng của các axit C18:3 (n-6), C18:4
(n-3) tăng và hàm lƣợng axit C20:5 (n-3) giảm. Thay đổi này đƣợc cho là do độ sâu cƣ trú tăng lên thì hàm lƣợng tảo cộng sinh khơng nhiều, mặt khác còn liên quan đến sự thay đổi chuỗi thức ăn ở các tầng nƣớc khác nhau. Các lipit trung tính của các mẫu đó có mức cao của các axit C18:1 (n-9) và C22:6 (n-3).
Về thành phần axit béo trong lipit phân cực của 12 lồi san hơ đƣợc lấy từ đảo Okinawa - Nhật Bản 38, các axit béo đều có mạch từ 14 đến 22 nguyên tử carbon, còn trong thành phần axit béo của lồi san hơ mềm Lobophytum crassum không
phát hiện ra axit có mạch 24 ngun tử carbon. Tuy khơng nhận dạng đƣợc sự có mặt của axit béo mạch nhánh nào, nhƣng đã phát hiện ra hàm lƣợng tới 4% (so với tổng hàm lƣợng axit béo) của axit 2-hidroxy - C16:0. Axit béo chính là axit palmitic, chiếm 15,8% trong loài Poritescylindrica, 54,8% trong loài G. fascicularis. Các lồi có sự vƣợt trội hàm lƣợng tổng axit các dãy (n-3) và (n-6)
trong lipit phân cực là các loài Porites lutea, P. cylindrical, Tubastrea sp. và Lobophytum crassum.
Trong lipit phân cực của 4 dạng Gorgonaria loài Pseudopterogorgia, 5 dạng
Gorgonaria loài Eunicea và 2 dạng Gorgonaria loài Gorgonia 16, 17 các axit
chính là C16:0, C18:3 C18:4 (n-3), C20:4 (n-6), C22:6 (n-3), C24:5 (n-6) và C24:6 (n-3), chiếm ƣu thế là dãy axit (n-6). Trong thành phần axit béo ở lipit phân cực của san hơ Gersemia rubiformis, thành phần chính là các axit C20:4 (n-6), C20:5 (n-3), C24:5 (n-6) và C20:1 (n-7) 25, 26.
So sánh với các lipit trung tính thì trong lipit phân cực của loài Alcyonaria nƣớc lạnh này mức của các axit dãy (n-6) là: C20:4 (n-6); C22:4 (n-6) và C24:5 (n- 6) có giá trị cao hơn và t lệ axit (n-6)/(n-3) = 2,6. Tổng các axit béo có mạch 24 nguyên tử carbon trong lipit phân cực lớn hơn 1,5 lần so với trong lipit tổng và chiếm 14,7% của tổng axit béo.
Nghiên cứu thành phần lipit tổng của san hô kiến tạo rạn Montipora informis chỉ ra rằng, trong lipit tổng có chứa axit dãy (n-3) và (n-6) mạch 24 nguyên tử carbon nhiều hơn trong lipit phân cực. 38
1.5.3 Axit béo của san hơ có tảo cộng sinh Zooxanthellae
Hầu hết các lồi san hơ có chứa tảo cộng sinh Zooxanthellae, chúng là các vi tảo sống cộng sinh (symbiotic) bên trong mô của san hô. Các dạng san hô này không thể tồn tại nếu thiếu Zooxanthellae, trong trƣờng hợp bị mất Zooxanthellae,
sự phổ biến của chúng trong san hơ khơng đƣợc khơi phục và tập đồn sẽ bị chết. Điều này đã đƣợc quy định bởi các Zooxanthella hóa hợp trong quá trình quang hợp các chất hữu cơ, là cơ sở thức ăn của các dạng san hô cộng sinh. Thành phần, hàm lƣợng của lipit và axit béo trong tảo cộng sinh Zooxanthellae so với san hô
khơng cịn tảo cộng sinh là khác nhau đáng kể. Trong hầu hết các phép phân tích thành phần và hàm lƣợng axit béo từ lipit tổng là hỗn hợp lipit của tảo cộng sinh
Đã có các chứng cớ xác đáng nghiêng về lý thuyết chuyển giao lipit và axit béo từ tảo cộng sinh Zooxanthellae sang các mô vật chủ, tuy nhiên số lƣợng các
cơng trình nghiên cứu thành phần lipit của Zooxanthellae sạch và phần chiết các
lipit đƣợc làm sạch khỏi vật cộng sinh là khơng nhiều, trƣớc hết là do khó khăn lớn về phƣơng pháp luận khi nghiên cứu các phần chiết mô sạch.
Khi nghiên cứu về thành phần và hàm lƣợng lipit trong mơ của san hơ cứng lồi Pocillopora capitata, Patton 34 đã chỉ ra rằng, thành phần và phân bố lipit
của các mô trong san hô cứng bao gồm 30% sáp, 38% triaxylglyxerol và 13% phospholipit, rất khác biệt so với Zooxanthellae của nó bao gồm 2% sáp, 5%
triaxylglyxerol và 12% phospholipit.
Thành phần và hàm lƣợng axit béo từ lipit tổng, của monogalactosyldiaxyl- glyxerol (MGG) và digalactosylaxyl-glyxerol (DGG) của tảo cộng sinh
Zooxanthellae đƣợc rút ra từ 5 dạng san hô họ Acroporidae, 2 dạng Faviidae và 1
dạng Pocilloporidae đã đƣợc Bishop và Kenrick nghiên cứu 10. Các axit béo
chính trong lipit tổng của tảo cộng sinh Zooxanthellae là C16:0, C18:3 (n-6),C18:4 (n-3) C18:5 (n-3), C20:5 (n-3) và C22:6 (n-3). Đáng chú ý là hàm lƣợng cao của axit C18:5 (n-3) trong lipit tổng của tảo cộng sinh Zooxanthellae ở loài Acropora nasuta, hàm lƣợng axit C18:5 (n-3) đạt tới 7,6%. Axit này đƣợc coi là đặc trƣng của các diflagellate chuyển động tự do, nó đặc trƣng cho các vật thể quang hợp, thực tế khơng có mặt trong các mơ của vật chủ. Nhƣ vậy chỉ số đặc trƣng trong tảo cộng sinh Zooxanthellae gồm các axit chính là C18:3 (n-6), C18:4 (n-3), C18:5 (n- 3) và C20:5 (n-3).
Các kiểu khác nhau về thành phần tảo cộng sinh thì nguyên tắc là khác nhau về kích thƣớc tế bào, hình dạng, các thành phần cơ cấu, khả năng quang hợp, các sản phẩm sơ cấp, sự tích tụ sắc tố, tốc độ cực đại của sự phân chia và thoái hoá tế bào. Khi nghiên cứu thành phần axit béo của lipit phân cực và triaxylglyxerol của
Millepora intricata chứa các tảo cộng sinh L (livid – màu chì), san hơ kiến tạo rạn
lồi Pocillopora damicornis chứa các tảo cộng sinh C (carmine - tảo đỏ), tảo cộng sinh G (Green - tảo xanh) trong các loài Seriatopora caliendrum và Seriatopora hystrix, cịn trong lồi Stylophora pistillata đã phát hiện chứa cả hai tảo cộng sinh
C và G 31.
Axit béo chính trong thành phần chứa tảo cộng sinh L lấy ra từ loài Millepora
intricata là C16:0, C18:4 (n-3), C18:5 (n-3), C22:5 (n-6) và C22:6 (n-3), trong khi
đó axit C20:5 (n-3) và C20:4 (n-6) có mặt với hàm lƣợng khơng đáng kể. Thành phần axit béo chứa tảo cộng sinh C từ loài Pocillopora damicornis và G từ hai dạng
Seriatopora tƣơng đối giống nhau. Trong các axit C16:0, C18:4 (n-3), C20:4 (n-6),
C20:5 (n-3) và C22:6 (n-3) thì C18:4 (n-3) có hàm lƣợng lớn hơn trong kiểu C so với kiểu G (tƣơng ứng 17,5% và 10%); cịn đối với axit C22:6 (n-3) thì ngƣợc lại (tƣơng ứng 9,6% và 16,4%). Các lipit phân cực của hai kiểu C và G đều có hàm lƣợng axit C18:5 (n-3) thấp, chỉ khoảng 1%. Hai kiểu cộng sinh C và G so với kiểu cộng sinh L trong lồi Millepora intricata thì khác nhau đáng kể bởi hàm lƣợng
axit dãy (n-6) là C18:3 (n-6) và C20:4 (n-6). Còn thành phần và hàm lƣợng axit béo trong kiểu cộng sinh C và G ở loài Stylophora pistillata nói chung là giống nhƣ ở hai kiểu cộng sinh C và G 39, 36. Các axit béo trong lớp chất triaxylglyxerol
của tảo cộng sinh đƣợc phân biệt theo hàm lƣợng bốn axit chính là C16:0, C16:1 (n-7), C18:0 và C22:6 (n-3). Nhƣ trong cộng sinh kiểu L thì triaxylglyxerol có hàm lƣợng axit C18:0 là cao hơn (20%), cịn trong cộng sinh kiểu C và G thì hàm lƣợng axit này không vƣợt quá 5% hàm lƣợng axit tổng. Trong cộng sinh kiểu L, hàm lƣợng axit C16:1 (n-7) là thấp (1%), khác với kiểu C và G, có hàm lƣợng tƣơng ứng khoảng 6 và 12%. Trong kiểu cộng sinh C và G hàm lƣợng axit C16:0 vƣợt hàm lƣợng axit C22:6 (n-3) gấp gần 2 lần 35, 37.
Khi nghiên cứu về san hô kiến tạo rạn Montipora digitata, Papina 26 đã định dạng 14 axit trong san hô và phần chiết nguyên từ tảo cộng sinh Zooxanthellae
(hình 1.10). Axit C16:0 là thành phần chính trong Zooxanthellae và trong cơ thể san hô, hàm lƣợng tƣơng ứng là 32,7 và 50,2%. Các axit chủ đạo trong
Zooxanthellae là C18:3 (n-6), C18:1 (n-9), C18:0, C18:4 (n-3), C16:1, C22:6 (n-3)
và C20:5 (n-3), cịn trong các mơ cơ của san hô là C16:1, C18:0, C18:1(n-9), C18:3 (n-6), C22:4 (n-6) và C20:4 (n-6). Số lƣợng tiếp theo các axit là C18:3 (n-3) và C18:5 (n-3) chỉ đƣợc phát hiện trong phần chiết Zooxanthellae, trong mô san hô
chúng vắng mặt hồn tồn. Axit béo có mạch với số ngun tử carbon lẻ và axit C18:1 (n-7) đƣợc cho là yếu tố đánh dấu các vi khuẩn, thực tế vắng mặt trong
Zooxanthellae và đƣợc tìm thấy với hàm lƣợng nhỏ trong tế bào san hô. Sự khác
biệt có ý nghĩa về mặt thống kê (P< 0,05) của thành phần axit béo ở Zooxanthellae so với ở cơ thể san hô là hàm lƣợng tăng hơn của tổng axit PUFAs các dãy n-3 và axit C18:2 (n-6) cũng nhƣ hàm lƣợng giảm đi của C16:0.
Hình 1.10: Các axit béo của san hơ với phần chiết nguyên chất của tảo cộng sinh 26. của tảo cộng sinh 26.
Mức bức xạ ánh sáng của mặt trời cùng với sự tăng lên của nhiệt độ (việc tạo các điều kiện nhân tạo mất màu san hô) ảnh hƣởng lớn lên thành phần và hàm lƣợng các axit béo trong cơ thể san hô và phần chiết Zooxanthellae của san hô kiến tạo rạn Montipora digitata 21, 34.
Tăng mức độ bức xạ ánh sáng và nhiệt độ gây ra sự giảm đi của phần axit béo chính cả trong tế bào san hơ cũng nhƣ trong Zooxanthellae. Các thay đổi này là dễ nhận thấy nhất trong tế bào cơ thể san hơ, nó liên quan tới tính nhạy cảm cao của
Zooxanthellae đối với sự thay đổi của các điều kiện môi trƣờng xung quanh, hoặc
CHƢƠNG II: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Phạm vi, đối tƣợng nghiên cứu: 2.1 Phạm vi, đối tƣợng nghiên cứu:
Đối tƣợng nghiên cứu
Các mẫu san hô nghiên cứu đƣợc thu thập tại các vùng biển Nha Trang do nhóm nghiên cứu của GS.TS Phạm Quốc Long - Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam thu thập vào tháng 6, tháng 7 năm 2012 để nuôi nhân tạo. Các mẫu san hô nghiên cứu đƣợc các chuyên gia giám định và lƣu giữ tiêu bản tại phịng thí nghiệm Sinh hóa hữu cơ - Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên.
Trong 6 lồi san hơ gồm:
Gồm 6 loài thuộc 5 giống (Lobophytum; Sinularia; Sarcophyton; Clavularia;
Gorgonaria) của 3 họ (Alcyoniidae; Xeniidae; Gorgoniidae).
Bảng 2.1: Tên loài, giống, họ và thứ tự của các mẫu san hô mềm
Họ Giống Loài TT mẫu
Họ Alcyoniidae
Lobophytum
Lobophytum sp. 1
Lobophytum camatum 2
Sinularia Sinularia leptoclados 3
Sarcophyton Sacophyton poculiformer 4
Họ Xeniidae Clavularia Clavularia sp. 5
3.Sinularia leptoclados 4. Sarcophytum poculiformer
5. Loài Clavularia sp. 6. Lồi Nicaule crucifera Hình 2.1: Ảnh tiêu bản 6 lồi san hơ mềm nghiên cứu
Phạm vi nghiên cứu
- Phạm vi khơng gian: phịng thí nghiệm Sinh hóa hữu cơ - Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên và trƣờng đại học tài nguyên và môi trƣờng Hà Nội
- Phạm vi thời gian: Từ tháng 06/2018 đến tháng 12/2018.
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 2.2.1 Phƣơng pháp thu thập tài liệu 2.2.1 Phƣơng pháp thu thập tài liệu
2.2.2 Phƣơng pháp nuôi san hô nhân tạo
Đề tài nghiên cứu ảnh hƣởng của nhiệt độ đến thành phần và hàm lƣợng các lớp chất lipit của một số loài san hô mềm khi bị tẩy trắng ở quy mô phịng thí nghiệm. Do vậy thí nghiệm đƣợc thực hiện nhƣ sau:
Chuẩn bị 1 bể đối chứng có thể tích 600 L: bể này đảm bảo độ muối ổn định, nhiệt độ luôn nằm trong khoảng 24-280C, pH ổn định trong khoảng 8 và DO trong khoảng 6-8mg/l.
Chuẩn bị bể 2 là bể tăng nhiệt độ với thể tích 300 L: Tăng nhiệt độ (nhiệt độ đƣợc tăng lên từ từ bằng các tăng nhiệt điện tử) trong 2 giai đoạn:
- Giai đoạn 1: Tăng nhiệt từ 28-320
C - Giai đoạn 2: Tăng nhiệt lên trên 320
C
Thời gian ni san hơ: q trình ni sẽ đƣợc thực hiện trong 3 tuần Bổ sung thức ăn cho san hô là ấu trùng artemia 1 lần/1 ngày.
Đồng thời theo dõi thí nghiệm: thƣờng xuyên theo dõi các yếu tố nhiệt độ, độ muối, ơxy hồ tan, pH... 5-8 tiếng 1 lần. Đảm bảo đủ ánh sáng, sục khí cho các bể ni san hô. Theo dõi các biểu hiện của san hô nhƣ co duỗi xúc tu, hiện tƣợng bắt mồi, màu sắc (hiện tƣợng mất màu) đối với sự biến đổi của nhiệt độ, ngƣỡng tác động và khoảng thời gian tác động. Q trình ni thí nghiệm và theo dõi sẽ đƣợc ghi chép vào sổ nhật ký và bảng biểu theo dõi thí nghiệm.
Các bể thí nghiệm đƣợc đặt trong phịng thống khí, có hệ thống cửa kính và đèn chiếu sáng đảm bảo đủ ánh sáng cho tảo cộng sinh trong san hô quanh hợp. Sục khí 24/24 trong suốt q trình thí nghiệm.
Xử lý nƣớc: nƣớc đƣợc đƣợc xử lý qua hệ thống lắng thẩm thấu và bốc hơi nƣớc để đạt đến độ mặn hợp lý. Trong q trình ni nƣớc đƣợc tuần hồn qua hệ thống lọc sinh học.
Hình 2.2: San hơ bị tẩy trắng trong bể nuôi bởi yếu tố môi trƣờng bất lợi
2.2.3 Phƣơng pháp phân lập các lớp chất
Thực nghiệm phân lập các lớp chất trong lipit tổng trong san hô sống điều kiện thƣờng; trong san hô bị tẩy trắng bởi tăng nhiệt độ
Tách lipit tổng
Lipit tổng đƣợc tách theo phƣơng pháp E.G Bligh và W.J Dyer, 1959 22. Thực nghiệm: mẫu san hô (300g) đƣợc rửa sạch nhiều lần để loại sạch muối vơ cơ, sau đó nghiền nhỏ và đƣợc đƣợc khuấy trộn đều với 300ml CHCl3 và 600ml CH3OH, sau 15 phút bổ sung tiếp 300ml CHCl3 và 300 ml H2O. Cho bình đựng mẫu vào siêu âm 30 phút rồi tiến hành lọc trên giấy lọc. Bổ sung tiếp 300ml H2O để phân thành 2 lớp, lớp trên gồm CH3OH, H2O và các tạp chất khác, lớp dƣới gồm
CHCl3 và lipit đƣợc tách ra. Cô cất chân không dƣới áp suất thấp thu đƣợc lipit tổng.
Hình 2.3: Cất chân không tại PTN Tách chiết lớp chất lipit tổng
Xác định thành phần và hàm lƣợng các lớp chất trong lipit tổng
Thực nghiệm: Chấm lên bản mỏng silicagel (6 6 cm) 3 vệt lipit với cấp độ
5l; 10l và 15l, chạy trong hệ dung môi C6H12 : (CH3CH2)2O : AcOH = 80:20:1
(v:v:v) (hoặc C6H6 : (CH3CH2)2O : AcOH = 70:30:1 (v:v:v)) hiện hình bằng H2SO4/MeOH 10%. Sấy bản mỏng ở nhiệt độ 1800C trong thời gian 10 phút, scan trên máy Epson Perfection 2400 PHOTO (Nagano, Japan).
Phần trăm của các lớp chất trong lipit tổng đƣợc xác định dựa trên sự đo diện tích và cƣờng độ màu xám trong chƣơng trình phân tích hình ảnh Sorbfil TLC Videodensitometer DV (Krasnodar, Russia). Đơn vị tính tốn là đơn vị tiêu chuẩn
Ví dụ: Khi phân tích hàm lƣợng các lớp chất trong lipit tổng của một mẫu san hô, ta đƣợc kết quả từ máy nhƣ sau:
Rf: Độ dịch chuyển của các chất trong sắc ký lớp mỏng, 0< Rf <1 %S: Hàm lƣợng các lớp chất trong lipit tổng
Trên biểu đồ xuất hiện 6 chất với 07 giá trị của Rf
1. Lớp chất photpholipit (PL): Rf = (0,06 và 0,14); %S = 20 3. Lớp chất Sterol (ST): Rf = 0,26; %S = 4,9%.
4. Lớp chất axit béo tự do (FFA) : Rf = 0,32; %S = 3,5 5: Lớp chất triaxylglyxerol (TAG): Rf = 0,54; %S = 8,4.
6: Lớp chất monoankyldiaxylglyxerol ( MADAG): Rf =0,69; %S = 0,8 7: Lớp chất hydrocacbon (HC): Rf = 0,95; %S = 58,5
Metyl hoá axit béo trong lipit tổng
Đây là phản ứng este hóa chéo nhằm tạo ra dẫn xuất metyl ester để rồi nhận dạng bằng GC và GC-MS.
Thực nghiệm: Lấy 10-15mg lipit cho vào ống nghiệm, thêm 0,25-0,3ml C6H6,
sau đó thêm tiếp 0,25 ml MeONa/MeOH 1%, lắc kĩ rồi đun ở to
= 45-500C khoảng 15 phút. Lấy ra để nguội rồi thêm tiếp 1ml HCl 5%, tiếp tục đun nóng ở nhiệt độ trên 45-500C khoảng 15 phút, lấy ra để nguội rồi thêm 2ml n-hexan và 1ml H2O, lắc mạnh, để phân lớp rồi hút lấy lớp chất metyleste ở trên. Cất dịch chiết ở nhiệt
PL ST T FFA TAG MADAG HC
độ thấp tới kiệt, thêm 0,5ml CHCl3 rồi điều chế trên bản mỏng tráng sẵn Silica gel 60GF254, cắt rìa bản mỏng để phun thuốc thử là dung dịch H2SO4/MeOH 10%, hơ nóng để phát hiện vệt chất, ghép lại bản mỏng nhƣ cũ để xác định vùng chất, sau đó cạo lớp Silica gel có chất, giải hấp phụ và tinh chế lại bằng cách kết tinh trong dung mơi CHCl3 đem phân tích bởi GC và GC – MS.
Máy sắc ký khí (GC) hãng Shimadzu (Kyoto, Nhật Bản) với detector ion hóa ngọn lửa, cột Supercowax 10 (Supelco, Bellefonte, PA, USA), kích thƣớc cột 30m x 0.25mm ID. Khí mang He với tốc độ 30 cm/s
Máy sắc ký khí kết nối khối phổ (GC-MS) hãng Shimadzu GCMS QP5050A (Kyoto, Nhật Bản), cột sắc kí MND 5s (Supelco, Bellefone, PA, USA) với kích thƣớc cột 30m x 0.25 mm ID. Khí mang He với tốc độ khí là 30 cm/s.
CHƢƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Hàm lƣợng lipit tổng của 6 lồi san hơ nghiên cứu 3.1 Hàm lƣợng lipit tổng của 6 lồi san hơ nghiên cứu