của tảo cộng sinh 26.
Mức bức xạ ánh sáng của mặt trời cùng với sự tăng lên của nhiệt độ (việc tạo các điều kiện nhân tạo mất màu san hô) ảnh hƣởng lớn lên thành phần và hàm lƣợng các axit béo trong cơ thể san hô và phần chiết Zooxanthellae của san hô kiến tạo rạn Montipora digitata 21, 34.
Tăng mức độ bức xạ ánh sáng và nhiệt độ gây ra sự giảm đi của phần axit béo chính cả trong tế bào san hơ cũng nhƣ trong Zooxanthellae. Các thay đổi này là dễ nhận thấy nhất trong tế bào cơ thể san hơ, nó liên quan tới tính nhạy cảm cao của
Zooxanthellae đối với sự thay đổi của các điều kiện môi trƣờng xung quanh, hoặc
CHƢƠNG II: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Phạm vi, đối tƣợng nghiên cứu: 2.1 Phạm vi, đối tƣợng nghiên cứu:
Đối tƣợng nghiên cứu
Các mẫu san hô nghiên cứu đƣợc thu thập tại các vùng biển Nha Trang do nhóm nghiên cứu của GS.TS Phạm Quốc Long - Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam thu thập vào tháng 6, tháng 7 năm 2012 để nuôi nhân tạo. Các mẫu san hô nghiên cứu đƣợc các chuyên gia giám định và lƣu giữ tiêu bản tại phịng thí nghiệm Sinh hóa hữu cơ - Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên.
Trong 6 lồi san hơ gồm:
Gồm 6 loài thuộc 5 giống (Lobophytum; Sinularia; Sarcophyton; Clavularia;
Gorgonaria) của 3 họ (Alcyoniidae; Xeniidae; Gorgoniidae).
Bảng 2.1: Tên loài, giống, họ và thứ tự của các mẫu san hơ mềm
Họ Giống Lồi TT mẫu
Họ Alcyoniidae
Lobophytum
Lobophytum sp. 1
Lobophytum camatum 2
Sinularia Sinularia leptoclados 3
Sarcophyton Sacophyton poculiformer 4
Họ Xeniidae Clavularia Clavularia sp. 5
3.Sinularia leptoclados 4. Sarcophytum poculiformer
5. Loài Clavularia sp. 6. Lồi Nicaule crucifera Hình 2.1: Ảnh tiêu bản 6 lồi san hơ mềm nghiên cứu
Phạm vi nghiên cứu
- Phạm vi khơng gian: phịng thí nghiệm Sinh hóa hữu cơ - Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên và trƣờng đại học tài nguyên và môi trƣờng Hà Nội
- Phạm vi thời gian: Từ tháng 06/2018 đến tháng 12/2018.
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 2.2.1 Phƣơng pháp thu thập tài liệu 2.2.1 Phƣơng pháp thu thập tài liệu
2.2.2 Phƣơng pháp nuôi san hô nhân tạo
Đề tài nghiên cứu ảnh hƣởng của nhiệt độ đến thành phần và hàm lƣợng các lớp chất lipit của một số lồi san hơ mềm khi bị tẩy trắng ở quy mơ phịng thí nghiệm. Do vậy thí nghiệm đƣợc thực hiện nhƣ sau:
Chuẩn bị 1 bể đối chứng có thể tích 600 L: bể này đảm bảo độ muối ổn định, nhiệt độ luôn nằm trong khoảng 24-280C, pH ổn định trong khoảng 8 và DO trong khoảng 6-8mg/l.
Chuẩn bị bể 2 là bể tăng nhiệt độ với thể tích 300 L: Tăng nhiệt độ (nhiệt độ đƣợc tăng lên từ từ bằng các tăng nhiệt điện tử) trong 2 giai đoạn:
- Giai đoạn 1: Tăng nhiệt từ 28-320
C - Giai đoạn 2: Tăng nhiệt lên trên 320
C
Thời gian ni san hơ: q trình ni sẽ đƣợc thực hiện trong 3 tuần Bổ sung thức ăn cho san hô là ấu trùng artemia 1 lần/1 ngày.
Đồng thời theo dõi thí nghiệm: thƣờng xuyên theo dõi các yếu tố nhiệt độ, độ muối, ơxy hồ tan, pH... 5-8 tiếng 1 lần. Đảm bảo đủ ánh sáng, sục khí cho các bể ni san hô. Theo dõi các biểu hiện của san hô nhƣ co duỗi xúc tu, hiện tƣợng bắt mồi, màu sắc (hiện tƣợng mất màu) đối với sự biến đổi của nhiệt độ, ngƣỡng tác động và khoảng thời gian tác động. Q trình ni thí nghiệm và theo dõi sẽ đƣợc ghi chép vào sổ nhật ký và bảng biểu theo dõi thí nghiệm.
Các bể thí nghiệm đƣợc đặt trong phịng thống khí, có hệ thống cửa kính và đèn chiếu sáng đảm bảo đủ ánh sáng cho tảo cộng sinh trong san hô quanh hợp. Sục khí 24/24 trong suốt q trình thí nghiệm.
Xử lý nƣớc: nƣớc đƣợc đƣợc xử lý qua hệ thống lắng thẩm thấu và bốc hơi nƣớc để đạt đến độ mặn hợp lý. Trong q trình ni nƣớc đƣợc tuần hồn qua hệ thống lọc sinh học.
Hình 2.2: San hơ bị tẩy trắng trong bể nuôi bởi yếu tố môi trƣờng bất lợi
2.2.3 Phƣơng pháp phân lập các lớp chất
Thực nghiệm phân lập các lớp chất trong lipit tổng trong san hô sống điều kiện thƣờng; trong san hô bị tẩy trắng bởi tăng nhiệt độ
Tách lipit tổng
Lipit tổng đƣợc tách theo phƣơng pháp E.G Bligh và W.J Dyer, 1959 22. Thực nghiệm: mẫu san hô (300g) đƣợc rửa sạch nhiều lần để loại sạch muối vơ cơ, sau đó nghiền nhỏ và đƣợc đƣợc khuấy trộn đều với 300ml CHCl3 và 600ml CH3OH, sau 15 phút bổ sung tiếp 300ml CHCl3 và 300 ml H2O. Cho bình đựng mẫu vào siêu âm 30 phút rồi tiến hành lọc trên giấy lọc. Bổ sung tiếp 300ml H2O để phân thành 2 lớp, lớp trên gồm CH3OH, H2O và các tạp chất khác, lớp dƣới gồm
CHCl3 và lipit đƣợc tách ra. Cô cất chân không dƣới áp suất thấp thu đƣợc lipit tổng.
Hình 2.3: Cất chân không tại PTN Tách chiết lớp chất lipit tổng
Xác định thành phần và hàm lƣợng các lớp chất trong lipit tổng
Thực nghiệm: Chấm lên bản mỏng silicagel (6 6 cm) 3 vệt lipit với cấp độ
5l; 10l và 15l, chạy trong hệ dung môi C6H12 : (CH3CH2)2O : AcOH = 80:20:1
(v:v:v) (hoặc C6H6 : (CH3CH2)2O : AcOH = 70:30:1 (v:v:v)) hiện hình bằng H2SO4/MeOH 10%. Sấy bản mỏng ở nhiệt độ 1800C trong thời gian 10 phút, scan trên máy Epson Perfection 2400 PHOTO (Nagano, Japan).
Phần trăm của các lớp chất trong lipit tổng đƣợc xác định dựa trên sự đo diện tích và cƣờng độ màu xám trong chƣơng trình phân tích hình ảnh Sorbfil TLC Videodensitometer DV (Krasnodar, Russia). Đơn vị tính tốn là đơn vị tiêu chuẩn
Ví dụ: Khi phân tích hàm lƣợng các lớp chất trong lipit tổng của một mẫu san hô, ta đƣợc kết quả từ máy nhƣ sau:
Rf: Độ dịch chuyển của các chất trong sắc ký lớp mỏng, 0< Rf <1 %S: Hàm lƣợng các lớp chất trong lipit tổng
Trên biểu đồ xuất hiện 6 chất với 07 giá trị của Rf
1. Lớp chất photpholipit (PL): Rf = (0,06 và 0,14); %S = 20 3. Lớp chất Sterol (ST): Rf = 0,26; %S = 4,9%.
4. Lớp chất axit béo tự do (FFA) : Rf = 0,32; %S = 3,5 5: Lớp chất triaxylglyxerol (TAG): Rf = 0,54; %S = 8,4.
6: Lớp chất monoankyldiaxylglyxerol ( MADAG): Rf =0,69; %S = 0,8 7: Lớp chất hydrocacbon (HC): Rf = 0,95; %S = 58,5
Metyl hoá axit béo trong lipit tổng
Đây là phản ứng este hóa chéo nhằm tạo ra dẫn xuất metyl ester để rồi nhận dạng bằng GC và GC-MS.
Thực nghiệm: Lấy 10-15mg lipit cho vào ống nghiệm, thêm 0,25-0,3ml C6H6,
sau đó thêm tiếp 0,25 ml MeONa/MeOH 1%, lắc kĩ rồi đun ở to
= 45-500C khoảng 15 phút. Lấy ra để nguội rồi thêm tiếp 1ml HCl 5%, tiếp tục đun nóng ở nhiệt độ trên 45-500C khoảng 15 phút, lấy ra để nguội rồi thêm 2ml n-hexan và 1ml H2O, lắc mạnh, để phân lớp rồi hút lấy lớp chất metyleste ở trên. Cất dịch chiết ở nhiệt
PL ST T FFA TAG MADAG HC
độ thấp tới kiệt, thêm 0,5ml CHCl3 rồi điều chế trên bản mỏng tráng sẵn Silica gel 60GF254, cắt rìa bản mỏng để phun thuốc thử là dung dịch H2SO4/MeOH 10%, hơ nóng để phát hiện vệt chất, ghép lại bản mỏng nhƣ cũ để xác định vùng chất, sau đó cạo lớp Silica gel có chất, giải hấp phụ và tinh chế lại bằng cách kết tinh trong dung mơi CHCl3 đem phân tích bởi GC và GC – MS.
Máy sắc ký khí (GC) hãng Shimadzu (Kyoto, Nhật Bản) với detector ion hóa ngọn lửa, cột Supercowax 10 (Supelco, Bellefonte, PA, USA), kích thƣớc cột 30m x 0.25mm ID. Khí mang He với tốc độ 30 cm/s
Máy sắc ký khí kết nối khối phổ (GC-MS) hãng Shimadzu GCMS QP5050A (Kyoto, Nhật Bản), cột sắc kí MND 5s (Supelco, Bellefone, PA, USA) với kích thƣớc cột 30m x 0.25 mm ID. Khí mang He với tốc độ khí là 30 cm/s.
CHƢƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Hàm lƣợng lipit tổng của 6 lồi san hơ nghiên cứu 3.1 Hàm lƣợng lipit tổng của 6 lồi san hơ nghiên cứu
Một trong các chỉ số chính của thành phần hố học một đối tƣợng sinh vật là hàm lƣợng lipit tổng của đối tƣợng đó. Hàm lƣợng lipit tổng thƣờng nhận đƣợc bằng cách chiết xuất từ các mô sinh vật bằng clorofom và metanol theo một trong các biến thể của phƣơng pháp Folch 23. San hô là loại động vật sống theo quần
thể, phần chính các lipit tổng chứa trong các nhánh polip của chúng. Các polyp liên tục phủ lên lớp mặt của quần thể đáy, mà thành phần chính của đáy là các chất vơ cơ với hàm lƣợng lipit nhỏ. Quan hệ giữa khối lƣợng polip và khối lƣợng đáy là biến đổi và phụ thuộc trƣớc hết vào kích thƣớc của quần thể san hơ đƣợc chọn lấy mẫu phân tích. Điều này gây ra khó khăn khi xác định hàm lƣợng lipit tổng và gây ra sự phân tán của các số liệu phân tích. Trong một loạt trƣờng hợp, phần lipit tổng thƣờng đƣợc thể hiện nhƣ là t lệ giữa khối lƣợng lipit và khối lƣợng của toàn bộ quần thể.
Bảng 3.1: Kết quả phân tích hàm lượng lipit tổng của 6 lồi san hơ mềm
Họ Giống Loài Hàm lƣợng Lipit tổng Họ Alcyoniidae Lobophytum Lobophytum sp. 2.2 Lobophytum camatum 1.6
Sinularia Sinularia leptoclados 2.0
Sarcophyton Sacophyton poculiformer 2.1
Họ Xeniidae Clavularia Clavularia sp. 1.2
Họ Gorgoniidae Gorgonaria Nicaule crucifera 1.4
Hàm lƣợng lipit tổng của 6 lồi san hơ mềm nghiên cứu dao động từ 1,2% đến 2,2% so với trọng lƣợng mẫu tƣơi (Bảng 3.1). Những lồi có hàm lƣợng cao
trong 6 loài nghiên cứu là Lobophytum sp.; Sinularia leptoclados; Sacophyton
poculiformer.
3.2 Kết quả phân tích hàm lƣợng các lớp chất trong lipit tổng 3.2.1 Phân tích định tính: 3.2.1 Phân tích định tính:
Để phân tích nhanh các lớp chất có mặt trong lipit tổng (phân tích định tính), thực nghiệm tiến hành lấy lipit tổng của các mẫu san hô chấm lên bản mỏng, hiện hình bằng H2SO4/MeOH 10%. Sấy bản mỏng ở nhiệt độ 1800C trong thời gian 10 phút, mỗi mẫu làm 3 lần và lấy giá trị trung bình của hàm lƣợng các lớp chất..
Hình 3.1: TLC của các lớp chất trong lipit tổng
Trong lipit tổng của các lồi san hơ mềm đã phân tích đƣợc 6 lớp chất, bao gồm: phospholipit (lipit phân cực, PL); strol (ST), axit béo tự do (FFA); triaxylglyxerol (TG); monoankyldiaxylglyxerol (MADAG), hydrocacbon (HC) và các chất khác chƣa định dạng đƣợc (AT).
Phân tích định lƣợng:
- Thực nghiệm: Chấm lên bản mỏng silicagel (6 6 cm) 3 vệt lipit với cấp độ 5l; 10l và 15l, chạy trong hệ dung môi C6H12 : (CH3CH2)2O : AcOH = 80:20:1 (v:v:v) (hoặc C6H6 : (CH3CH2)2O : AcOH = 70:30:1 (v:v:v)) hiện hình bằng
H2SO4/MeOH 10%. Sấy bản mỏng ở nhiệt độ 1800C trong thời gian 10 phút, scan trên máy Epson Perfection 2400 PHOTO (Nagano, Japan).
- Phần trăm của các lớp chất trong lipit tổng đƣợc xác định dựa trên sự đo diện tích và cƣờng độ màu xám trong chƣơng trình phân tích hình ảnh Sorbfil TLC Videodensitometer DV (Krasnodar, Russia). Đơn vị tính tốn là đơn vị tiêu chuẩn
trong phân tích các lớp chất lipit.
3.3 Hàm lƣợng các lớp chất trong lipit tổng của san hô mềm
Bảng 3.2: Thành phần và hàm lượng % các lớp chất trong lipit tổng của 6 lồi san hơ mềm
TT Lớp chất
Loài PL ST FFA TG MDAG HC
1 Lobophytum sp. 14.8 9.8 6.4 15.9 23.9 29.3 2 Lobophytum camatum 19.5 5.3 1.5 7.9 2.7 63.1 3 Sinularia leptoclados 31.8 9.6 2.8 8.7 3.1 40.4 4 Sacophyton poculiformer 41.3 14.3 5.2 6.1 6.0 27.1 5 Clavularia sp. 27.8 4.2 3.1 5.1 13.0 40.4 6 Nicaule crucifera 30.6 10.0 1.8 9.0 3.5 41.9
Hình 3.2: T lệ % các lớp chất trong lipit tổng của 6 lồi san hơ mềm Trong lipit tổng của các lồi san hơ mềm đã phân tích đƣợc 6 lớp chất, bao gồm: photpholipit (lipit phân cực, PL); sterol (ST), axit béo tự do (FFA);
HC: 40.4 MDAG: 8.7 AT: 2.2 PL: 27.6 FFA : 3.4 TG: 8.9 ST: 8.8
triaxylglyxerol (TG); monoankyldiaxylglyxerol (MADAG), hydrocacbon (HC) và các chất khác chƣa định dạng đƣợc (AT). Hàm lƣợng các lớp chất đƣợc trình bày ở bảng 3.2
Kết quả hàm lƣợng trung bình của hydrocacbon chiếm tới 40,4% tổng lƣợng của các chất đã phân tích đƣợc; Hàm lƣợng trung bình của lớp chất photpholipit trong 6 lồi san hơ mềm là 27,6%. Những lồi có hàm lƣợng photpholipit cao là
Sacophyton poculiformer (41,3%) hàm lƣợng hydrocacbon thấp là loài Lobophytum
sp. (14,8%).
Hàm lƣợng sterol ở các loài đã đƣợc nghiên cứu dao động từ 4.2% ở loài
Clavularia sp. đến 14,3% ở lồi Sacophyton poculiformer. Hàm lƣợng trung bình là
8,8%, cao hơn so với hàm lƣợng trung bình của những lồi san hơ cứng (4,47%) nghiên cứu ở trên.
Hàm lƣợng trung bình của axit béo tự do là 3,4%, cao hơn so với hàm lƣợng trung bình của san hơ cứng.
Lớp chất triaxylglyxerol chiếm hàm lƣợng 8,9% trong lipit tổng, thấp hơn nhiều so với trung bình của san hơ cứng (chiếm 26,33%).
Hàm lƣợng monoankyldiaxyglyxerol trung bình là 8,7%, đạt giá trị cao ở lồi
Lobophytum sp. (23.9%); loài Clavularia sp. (13%)
3.4 Nghiên cứu ảnh hƣởng của nhiệt độ lên sức khỏe của san hô. Thành phần, hàm lƣợng lipit, axit béo khi san hô bị tẩy trắng phần, hàm lƣợng lipit, axit béo khi san hô bị tẩy trắng
3.4.1 Khả năng thích ứng của san hơ trong điều kiện thay đổi nhiệt độ
Để kiểm chứng khả năng chịu đựng (hay khả năng thích ứng) của san hơ, đề tài đã tiến hành thí nghiệm với sự thay đổi của nhiệt độ trong điều kiện nuôi nhân tạo ở 6 lồi san hơ nghiên cứu. Đây là cơ sở để đánh giá mức độ ảnh hƣởng của nhiệt độ đối với san hơ ở mơi trƣờng tự nhiên khi có những tai biến bất thƣờng. Thí nghiệm đƣợc tiến hành trong 15 ngày.
3.4.1.1 San hô trong bể đối chứng
Các điều kiện môi trƣờng đƣợc giữ ổn định trong suốt q trình ni, trong đó độ muối ổn định, nhiệt độ luôn nằm trong khoảng 24-280
C (trung bình 25,50C), pH ổn định trong khoảng 8 và DO trong khoảng 6-8mg/L. Để đảm bảo đủ ánh sáng cho tảo quang hợp ngồi ánh sáng tự nhiên cịn sử dụng ánh sáng đèn compact. Thức ăn đƣợc bổ sung hằng ngày bằng ấu trùng artemia, sục khí và tuần hoàn nƣớc qua hệ thống lọc sinh học liên tục 24/24.
Trong suốt q trình thí nghiệm san hơ trong bể đối chứng ln khỏe mạnh, súc tu thị dài, thƣờng xuyên bắt mồi. Sau khi các lơ thí nghiệm kết thúc san hơ ở bể đối chứng khơng có tập đồn nào bị chết hay bị yếu.
3.4.2 Khả năng thích ứng của san hơ đối với nhiệt độ tăng cao
Trong các bể nuôi san hơ thí nghiệm, nhiệt độ đƣợc tăng lên từ từ bằng các tăng nhiệt điện tử. Trong dãy tăng nhiệt lên dần 280C rồi đến 320C trong khoảng thời gian 10 ngày, các biểu hiện của san hô vẫn diễn ra bình thƣờng thể hiện qua màu sắc vẫn tƣơi sáng, hoạt động của xúc tu và nƣớc vẫn trong sạch khơng có mùi trong bể ni san hơ mềm.
Khi nhiệt độ tăng trên 320 C:
Khi nhiệt độ tăng dần từ 28-310C trong 10 ngày đầu, các hoạt động và biểu hiện của san hơ vẫn diễn ra bình thƣờng, khỏe mạnh, màu sắc tƣơi sáng, xúc tu thò ra. Từ ngày thứ 11, nhiệt độ tăng lên trên 31,50C một số lồi bắt đầu có biểu hiện phản ứng với nhiệt nhƣ các loài của Lobophytum, Sarcophyton, xúc tu thò ngắn lại, còn các lồi khác vẫn hoạt động bình thƣờng.
Khi nhiệt độ lên 320C các hoạt động của san hô đã bị ảnh hƣởng rõ rệt, xúc tu đã có biển hiện thị ngắn, ít cử động, màu sắc bị nhạt hơn so với điều kiện bình thƣờng.
Tiếp tục tăng nhiệt độ lên 32,50
C một số loài tiết ra chất nhầy và chết sau 3 ngày. Các loài Nicaule crucifera; Clavularia sp. xúc tu co duỗi mặc dù phần gốc các polyp đã có biểu hiện bị mất màu. Tình trạng này kéo dài 2 ngày san hơ vẫn không chết đến khi nhiệt độ lên đến 330C san hơ mới bị chết.
3.4.3 Phân tích hàm lƣợng lipit tổng, hàm lƣợng các lớp chất trong lipit tổng của 6 lồi san hơ mềm khi bị tẩy trắng bởi nhiệt độ
3.4.3.1 Lớp chất lipit tổng của 6 lồi san hơ bị tẩy trắng
Bảng 3.3: Hàm lượng lipit tổng của 6 lồi san hơ mềm bị tẩy trắng bởi nhiệt độ và của tảo Zooxanthellea cộng sinh trong san hô khi chưa bị tẩy trắng