❖Nhận xét: Với chương trình chạy sắc ký đẳng dòng pic CIP bị doãng chân và không cân xứng. Với chương trình gradient cho đáp ứng pic của CIP, LEV, LOM có cường độ lớn nhất, pic cân xứng, không bị chẻ pic. Do đó chương trình gradient được lựa chọn để thiết lập phương pháp phân tích Ciprofloxacin và Levofloxacin trong nước thải.
3.2. Thẩm dịnh phương pháp nghiên cứu
3.2.1. Tối ưu hoá quá trình tách chiết
Mẫu nước thải của bệnh viện thường có thành phần rất phức tạp, hàm lượng chất cần phân tích khá thấp, không tương thích cho việc phân tích trực tiếp trên hệ sắc ký. Do vậy, trước khi phân tích mẫu chúng ta cần phải tách, làm giàu các hợp phần của mẫu cần phân tích. Có rất nhiều phương pháp xử lý mẫu như: lọc, bay hơi, làm khô, ly tâm, chiết lỏng- lỏng, sắc ký cột, chiết Soxhlet, SPE, vi sóng.... Qua tham khảo tài liệu, với những ưu điểm của phương pháp chiết pha rắn SPE, lựa chọn phương pháp này để xử lý mẫu. Tiến hành khảo sát thể tích chiết, dung môi rửa giải như sau:
* Khảo sát, lựa chọn thể tích mẫu chiết
Tiến hành chiết qua cột với 100 ml và 200 ml mẫu thử có thêm dung dịch chuẩn hỗn hợp nồng độ 50 ppb. Sau đó, tiến hành sắc ký với các điều kiện đã được khảo sát ở mục 3.1.1 và 3.1.2 như trên, kết quả hiệu suất chiết ở từng điều kiện như sau:
Bảng 3.4. Hiệu suất chiết kháng sinh quinolon ở thể tích chiết 100ml và 200ml
Kháng sinh
V chiết 100ml V chiết 200ml
S pic Hiệu suất (%) S pic Hiệu suất (%)
CIP 78049 75,3 41362 41,9
LEV 96987 112,1 59888 52,6
IS 102461 102461
❖Nhận xét: Với thể tích chiết 100ml, sắc ký đồ cho pic rõ nét và ít tạp hơn so với khi chiết 200ml. Ngoài ra, hiệu suất chiết cao hơn hẳn so với khi chiết 200ml dịch. Có thể do với thể tích chiết lớn, vượt quá dung lượng cột, vì vậy, hiệu suất chiết của cột giảm. Do đó, chúng tôi chọn thể tích chiết 100ml để xử lý mẫu.
Sau khi chiết 100 ml dung dịch mẫu thử có nồng độ kháng sinh 50ppb qua cột, tiến hành khảo sát dung môi rửa giải với 2 dung môi MeOH, ACN, thể tích rửa giải là 10 ml. Kết quả hiệu suất chiết như sau:
Bảng 3.5. Hiệu suất chiết các kháng sinh quinolon khi dùng các dung môi rửa giải khác nhau
Kháng sinh Dung môi ACN Dung môi MeOH
S Hiệu suất (%) S Hiệu suất (%)
CIP 68240 68,8 70215 71,9
LEV 79486 77,4 95312 111,4
IS 101534 101534
❖Nhận xét: Với 2 loại dung môi này, khi rửa giải bằng MeOH cho sắc ký đồ rõ nét, ít tạp hơn và pic cân đối hơn so với dung môi ACN; hiệu suất chiết các kháng sinh quinolon cao hơn so với dung môi ACN. Do đó, chúng tôi dùng MeOH để rửa giải.
Đối với mẫu thử có nồng độ dư lượng kháng sinh cao, có thể xử lý loại tạp, chiết qua cột và phân tích, không cần cô cạn, làm giàu mẫu.
Từ những kết quả khảo sát ở trên, chúng tôi đưa ra quy trình định lượng kháng sinh trong nước thải cụ thể như sau:
* Quy trình xử lý mẫu
- Tiến hành xử lý với 100 ml nước thải như sau:
- Lọc nước thải 2 lần qua giấy lọc để xử lý sơ bộ để loại tạp - Acid hóa dịch lọc đến pH = 2 bằng dung dịch HCl 10%
- Hoạt hóa cột bằng 5ml MeOH → 5 ml H2O → 5ml H2O đã điều chỉnh pH = 2 bằng dung dịch HCl 10%
- Đưa mẫu lên cột: tốc độ 0,5- 1 ml/phút.
- Rửa cột: 10 ml H2O, làm khô cột trong 10 phút. - Rửa giải bằng 10ml MeOH.
- Cô cạn bằng khí trơ N2 đến khi thu được cắn, hòa tan cắn bằng 900 μL MeOH/H2O (60/40:v/v) và thêm 100 μL IS, lọc qua fillter 0,45 µl cho vào Vial và phân tích trên thiết bị LC-MS/MS.
3.2.2. Độ đặc hiệu (tính chọn lọc)
Để đánh giá tính chọn lọc của phương pháp chúng tôi thực hiện phân tích và so sánh phổ của các chất phân tích trên 3: mẫu trắng, mẫu chuẩn và mẫu thêm chuẩn (hình 3.3).