2.3.2 .Thiết bị, dụng cụ
2.4. Phương pháp nghiên cứu
2.4.1. Chuẩn bị mẫu
Mẫu nước thải bệnh viện được lấy tại bể đầu ra của hệ thống xử lý nước thải bệnh viện. Mẫu được chứa trong bình thủy tinh tối màu, bảo quản lạnh. Mẫu sau khi vận chuyển về phòng thí nghiệm được lọc hút chân không với màng lọc kích cỡ lỗ 0,45 µm (GF/F, Whatman) và được axit hóa tới pH<2 với axit HCl. Lưu giữ dịch lọc ở tủ lạnh âm sâu (-20oC) để chờ phân tích.
2.4.2. Quy trình tách và làm giàu mẫu phân tích
Dự kiến quy trình tách và làm giàu mẫu như sau (hình 2.1):
Mẫu nước thải: + 100ml mẫu chiết + 200ml mẫu chiết ↓ Cột chiết pha rắn ↓ Hoạt hóa cột:
5ml MeOH → 5 ml H2O → 5ml H2O đã điều chỉnh pH = 2 bằng dung dịch HCl 10% ↓ Nạp mẫu với tốc độ 0,5-1 ml/phút ↓ Rửa tạp chất: 10 ml H2O ↓
Thổi khô cột bằng bơm chân không, Rửa giải bằng: + 10ml MeOH
+ 10ml ACN ↓
Thổi khô bằng dòng khí N2 ↓
Hòa tan cắn bằng 900 μL MeOH/H2O (60/40:v/v) và thêm 100 μL IS
↓
Lọc qua fillter 0,45 µl cho vào Vial ↓
LC-MS/MS
Hình 2.1. Quy trình chiết và làm giàu mẫu
2.4.3. Khảo sát điều kiện sắc ký và phân tích khối phổ
2.4.2.1. Khảo sát điều kiện sắc ký
Tiến hành chạy thử trên từng kháng sinh CIP, LEV, LOM (nội chuẩn -IS) và hỗn hợp kháng sinh với IS trong dung môi pha động.
- Khảo sát điều kiện khối phổ
Khảo sát lựa chọn điều kiện nguồn Ion hóa, điều kiện bắn phá ion mẹ để tạo ion con, lựa chọn ion con để định lượng.
Chuẩn nội: Đảm bảo phân tách tốt và thời gian phân tích không quá dài, đáp ứng của chuẩn nội tốt. Chúng tôi quyết định chọn chuẩn nội để khảo sát là Lemofloxacin.
Cột sắc ký Agilent SB C18 (1,8 µm; 2,1×50 mm)
Chương trình pha động: Tiến hành khảo sát trên pha động ACN (0,1% HCOOH) : H2O (0,1% HCOOH) với tỉ lệ tt/tt khác nhau và chạy chế độ gradient.
Tốc độ dòng: Thay đổi lưu lượng pha động từ 0,1- 0,3 ml/phút để xác định được tốc độ phù hợp cho thời gian tối ưu.
Thể tích tiêm mẫu: Thay đổi lưu lượng mẫu từ 1- 5 µl để xác định được thể tích tiêm phù hợp cho sắc ký đồ đẹp, diện tích pic và độ đáp ứng cao
2.4.4. Thẩm định phương pháp
Sau khi khảo sát quá trình xử lý mẫu và các điều kiện sắc ký, tiến hành thẩm định phương pháp định lượng CIP và LEV bằng LC-MS/MS theo hướng dẫn của ICH và có tham chiếu theo quy định của AOAC.
2.4.4.1. Tính chọn lọc
Tính chọn lọc của phương pháp là khả năng đánh giá một cách rõ ràng chất cần phân tích khi có mặt các thành phần khác như tạp chất hoặc các chất cản trở khác.
Độ đặc hiệu của được đánh giá thông qua phân tích các dung dịch chuẩn, mẫu trắng và mẫu tự tạo (mẫu trắng có thêm kháng sinh nghiên cứu). Tiến hành như sau:
- Dung dịch chuẩn chứa các kháng sinh và chất chuẩn nội có nồng độ đã biết.
- Mẫu trắng (không chứa kháng sinh) xử lý theo qui trình đã xây dựng. - Mẫu tự tạo là mẫu trắng có thêm một lượng chính xác các kháng sinh
có nồng độ đã biết và chất chuẩn nội.
Tiến hành xử lý và sắc ký các dung dịch chuẩn, mẫu trắng và mẫu tự tạo theo các điều kiện đã chọn. Trên sắc kí đồ của mẫu trắng tại các thời điểm trùng với thời gian lưu của kháng sinh phải không xuất hiện các pic có các mảnh khối phổ tương ứng với số khối của chất phân tích trong mẫu chuẩn và chuẩn nội. Nếu có đáp ứng phải nhỏ hơn 1% so với nồng độ giữa của khoảng tuyến tính.
2.4.4.2. Tính thích hợp của hệ thống
Tính thích hợp hệ thống là phép thử nhằm đánh giá độ ổn định của toàn hệ thống phân tích bởi các yếu tố máy móc thiết bị.
Tiến hành sắc ký 6 lần liên tiếp trong cùng điều kiện một dung dịch chứa chất chuẩn kháng sinh và chất chuẩn nội. Đánh giá độ phù hợp của hệ thống thông qua các chỉ số sau đây:
- Giá trị RSD của thời gian lưu và diện tích pic của chất chuẩn nội và kháng sinh (nhỏ hơn 2%).
- Giá trị RSD của tỉ số diện tích pic của kháng sinh/chuẩn nội (nhỏ hơn 2%).
2.4.4.3. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)
Giới hạn phát hiện là nồng độ mà tại đó giá trị xác định được lớn hơn độ không đảm bảo đo của phương pháp. Đây là nồng độ thấp nhất của chất phân tích trong mẫu có thể phát hiện được nhưng chưa thể định lượng được. LOD được chấp nhận tại nồng độ mà tại đó tín hiệu lớn gấp 2-3 lần nhiễu đường nền, thông thường lấy S/N = 3.
Giới hạn định lượng của phương pháp (LOQ) là nồng độ thấp nhất của chất phân tích mà hệ thống phân tích định lượng được với tín hiệu phân tích có ý nghĩa định lượng so với tín hiệu của mẫu trắng hay tín hiệu nền. LOQ được chấp nhận tại nồng độ mà tại đó tín hiệu lớn gấp 10 lần nhiễu đường nến, thông thường lấy S/N = 10.
Trong đó: S: chiều cao tín hiệu của chất phân tích N: nhiễu đường nền.
Tiến hành pha loãng dung dịch thử đã xác định nồng độ đến nồng độ thấp nhất xác định được bằng sắc ký. Xác định tỷ lệ S/N. Để xác định LOD và LOQ của thiết bị, ta tiến hành như sau: chuẩn bị một mẫu trắng (chứa pha động), pha loãng mẫu chuẩn chứa hỗn hợp CIP và LEV nồng độ 1,5 mg/L đến khi nào sắc ký đồ thể hiện chiều cao pic khoảng gấp 3 lần đường nền thì nồng độ của mẫu chuẩn đó chính là giới hạn phát hiện LOD của thiết bị. Giới hạn định lượng được suy ra từ công thức: LOQ = 10/3 LOQ
2.4.4.4. Khoảng tuyến tính
Khoảng tuyến tính của một phương pháp phân tích là khoảng nồng độ ở đó có sự phụ thuộc tuyến tính giữa đại lượng đo được và nồng độ chất phân tích. Cách xác định khoảng tuyến tính:
- Từ dung dịch chuẩn gốc của các chất kháng sinh nghiên cứu tiến hành pha một dãy ít nhất 5 dung dịch chuẩn làm việc có nồng độ đã xác định trong khoảng tuyến tính cần khảo sát. Nồng độ nội chuẩn chuẩn trong mỗi dung dịch chuẩn được giữ cố định.
- Tiến hành sắc kí theo các điều kiện đã chọn.
- Xây dựng đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa tỉ lệ diện tích pic kháng sinh/nội chuẩn (SKS/SIS) (trục tung Oy) và nồng độ kháng sinh (trục hoành Oz).
- Thiết lập phương trình hồi qui tuyến tính dạng y = ax + b và hệ số tương quan r từ đó kết luận về độ tuyến tính của phương pháp.
2.4.4.5. Độ đúng và độ lặp lại
Độ đúng của phương pháp được tiến hành trên mẫu tự tạo (mẫu trắng có thêm một lượng chính xác kháng sinh và chất chuẩn nội có nồng độ đã biết). Tiến hành xử lý mẫu và phân tích rồi so sánh giá trị tính được theo đường chuẩn với giá trị chất thêm vào trong mẫu, tính độ thu hồi của các chất. Độ lặp lại của phương pháp được đánh giá thông qua giá trị RSD thu được khi phân tích 6 mẫu tự tạo khác nhau của một nồng độ. Tính lượng chuẩn thu hồi được theo phương trình hồi qui đã xây dựng và so sánh với lượng chuẩn thêm vào để đánh giá độ đúng của phương pháp.
2.4.4.6. Phương pháp tính toán và xử lý số liệu
- Sử Số liệu được xử lý trên Microsoft Office Excel 2010.
- Phương pháp xử lý số liệu thống kê được dùng để đánh giá độ chụm, độ đúng. Một số đại lượng thống kê sử dụng trong xử lý số liệu:
+ Giá trị trung bình X : n i i X n X 1 1 (2.1)
+ Độ lệch chuẩn S của phép đo (SD):
1 ) ( 1 2 n X X S n i i (2.2)
+ Độ lệch chuẩn tương đối (relative standard deviation) Sr:
X S
Sr .100% (2.3)
+ Giới hạn phát hiện (LOD):
N S
C
Cmin: Nồng độ nhỏ nhất mà chiều cao tín hiệu pic của chất phân tích gấp 3 lần tín hiệu đường nền. S/N: Tín hiệu nền.
+ Giới hạn định lượng (LOQ):
LOD
LOQ3,33. (2.5)
+ Độ chính xác của phép đo: Theo ISO, độ chính xác của phép đo được đánh giá qua độ đúng và độ chụm. Độ chụm là mức độ gần nhau của các giá trị riêng lẻ của các phép đo lặp lại. Độ đúng là mức độ gần nhau của giá trị phân tích với giá trị thực. Độ đúng được biểu diễn dưới dạng sai số tuyệt đối hoặc sai số tương đối. Sai số được tính theo công thức:
% 100 % t t i S S S X (2.6) n X X n i i tb 1 % % (2.7)
Trong đó: %X: Sai số phần trăm tương đối.
Si : giá trị đo được tại mỗi lần đo i.
St : giá trị tìm được theo lý thuyết (đường chuẩn). n: số lần đo.
+ Độ lặp lại của phép đo: Được xác định theo các đại lượng S2, CV.
2 S 1 ) ( 2 n S Si tb (2.8) 100 tb S S CV (2.9)
Trong đó: Stb: Nồng độ trung bình, n: số lần đo, S: độ lệch chuẩn
CV: hệ số biến động của phép đo.
+ Khoảng tin cậy: Z hay xZ (2.10) Với cơ số mẫu bé, σ chính là S hoặc SRD.
Trong nghiên cứu này với mức độ tin cậy là 96%, tương ứng với Z = 2 (quy tắc 2σ) được sử dụng để đánh giá độ tin cậy của phép đo.