1.3.5.2. Sắc ký lỏng
Sắc ký là quá trình tách xảy ra trên cột tách với pha tĩnh là chất rắn và pha động làm chất lỏng. Mẫu phân tích được chuyển lên cột tách dưới dạng
dung dịch. Khi tiến hành chạy sắc ký, các chất phân tích được phân bố liên tục giữa pha động và pha tĩnh. Trong hỗn hợp các chất phân tích, do cấu trúc phân tử và tính chất lí hóa của các chất khác nhau nên khả năng tương tác của chúng với pha tĩnh và pha động khác nhau. Do vậy chúng di chuyển với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau.
a.Cột sắc kí
Cột sắc kí đóng vai trò quan trọng trong việc tách các chất cần phân tích, nguyên liệu chủ yếu làm cột là thép không rỉ, chiều dài cột từ 1-30cm, kích thước hạt cỡ 3-15μm. Cột C18 là những hạt silica được phủ lên lớp hydrocarbon có mạch dài 18 C. Yêu cầu cột phải trơ, bền hóa học, bền nhiệt, chịu được axit, bazo ở khoảng pH rộng, ít bị ảnh hưởng của nhóm silanol Si- OH và chịu được áp suất cao. Cột có thể hư hỏng ngay cả khi sử dụng cột nhồi rất tốt từ các nhà sản xuất có tiếng như Water, Agilent, Alltech, HP, Phenomenex... Để kéo dài tuổi thọ của cột, chúng ta nên:
+ Tránh những thay đổi đột ngột điều kiện thí nghiệm(thay đổi tốc độ dòng, thay đổi pha động rất khác với pha động trước, thay đổi nhiệt độ, không làm rớt...).
+ Sử dụng cột bảo vệ.
+ Rửa cột kỹ sau khi sử dụng (nếu dùng đệm phải rửa thật kỹ, tránh hiện tượng lên men trong cột (ví dụ KH2PO4 – môi trường dinh dưỡng tốt).
+ Lưu giữ pha tĩnh trong acetonitrile, tránh lưu trong các alcohol như methanol (do có thể lên men yếm khí)
+ Luôn luôn đậy nắp kỹ để tránh dung môi bay hơi làm khô cột
b.Pha động
Hệ thống pha động gồm các bình chứa các dung môi, thường có 4 kênh A, B, C, D và có thể có một chai để rửa kim tiêm trong hệ thống bơm tự động (đối với hệ thống sắc kí lỏng của Thermo, còn đối với hệ thống của Agilent thì không có). Pha động thường là các dung môi MeOH, ACN, isopropyanol... đối với cột pha đảo hoặc là dung môi dichlorometan, chloroform, hexane đối với cột pha thường. Pha động sẽ vận chuyển và tương tác với chất cần phân tích, do đó chúng giữ vai trò quan trọng trong việc tách các chất phân tích.
Yêu cầu của pha động phải có độ tinh khiết cao, phải loại bỏ các khí hòa tan, để tránh hiện tượng tạo bọt khí làm tốc độ dòng không ổn định. Đối
với hệ thống HPLC-MS/MS chỉ được phép sử dụng pha động là các dung môi dễ bay hơi (tránh các dung môi không bay hơi như đệm phosphate, borate, citrate...).
c. Bơm cao áp
Tạo áp lực giúp pha động di chuyển trong hệ thống, tạo dòng ổn định ngay cả khi thành phần pha động thay đổi. Áp lực bơm sử dụng tùy thuộc vào tốc độ dòng, độ nhớt pha động, kích thước pha tĩnh. Có hai chế độ bơm:
- Đẳng dòng: Các thành phần pha động không thay đổi trong suốt quá trình chạy sắc ký.
- Gradient: Tỷ lệ hỗn hợp dung môi thay đổi trong quá trình chạy sắc ký. Chế độ gradient này phù hợp với mẫu phân tích chứa nhiều thành phần với khả năng phân cực khác nhau, giúp rút ngắn thời gian phân tích, tăng độ phân giải.
1.3.5.3. Khối phổ(Mass Spectrometry)
Phương pháp khối phổ (Mass Spectrometry- MS) là phương pháp nghiên cứu các chất bằng cách đo, phân tích chính xác khối lượng phân tử của chất đó dựa trên sự chuyển động của các ion nguyên tử hay ion phân tử trong một điện trường hoặc từ trường nhất định. Tỉ số giữa khối lượng và điện tích (m/z) có ảnh hưởng rất lớn đối với chuyển động này của ion. Nếu biết được điện tích của ion thì ta dễ dàng xác định được khối lượng của ion đó được.