Mẫu chuẩn
Mẫu trắng Mẫu thêm chuẩn
Thời gian lưu của các chất trên nền mẫu thêm chuẩn hoàn toàn giống với trên mẫu chuẩn, không xuất hiện pic ở mẫu trắng ở khoảng thời gian của các pic nói trên. Như vậy, phương pháp nghiên cứu có tính đặc hiệu đáp ứng được yêu cầu. Ngoài ra để xác định tính đặc hiệu của phương pháp LC- MS/MS chúng tôi sử dụng kỹ thuật tính số điểm IP (điểm nhận dạng- identification point) theo quyết định 657/2002/EC của Châu Âu. Đối với kỹ thuật sắc ký lỏng hai lần khối phổ, mỗi ion phân tử được tính 1 điểm, mỗi ion sản phẩm được tính 1,5 điểm. Trong nghiên cứu này, các dược phẩm được nhận dạng bởi 1 ion mẹ và 2 ion con, nên có số điểm IP là 4, do đó đáp ứng được yêu cầu Châu Âu.
3.2.3. Độ thích hợp của hệ thống
Tính thích hợp của hệ thống được đánh giá dựa trên giá trị RSD (%) của thời gian lưu và tỉ số diện tích chất phân tích/nội chuẩn sau 6 lần phân tích lặp lại cùng một mẫu hỗn hợp CIP, LEV và LOM ở các điều kiện sắc ký đã lựa chọn. Kết quả thể hiện trong bảng 3.6 cho thấy các giá trị RSD (%) đối với thời gian lưu của CIP, LEV và RSD của tỷ số diện tích CIP/IS, LEV/IS < 2% [85]. Như vậy các điều kiện sắc ký đã lựa chọn và hệ thống LC-MS/MS hoàn toàn phù hợp, đảm bảo ổn định cho phép phân tích đồng thời 2 chất kháng sinh CIP và LEV.
Bảng 3.6.Kết quả đánh giá tính thích hợp của hệ thống về thời gian và tỷ số diện tích của chất phân tích/nội chuẩn
TT IS Ciprofloxacin Levofloxacin Diện tích pick Thời gian lưu (phút) Diện tích pick Thời gian lưu (phút) Tỉ số diện tích (CIP/ IS) Diện tích pick Thời gian lưu (phút) Tỉ số diện tích (CIP/ IS) 1 278346 3.132 400373 3.112 1.438400 656775 3.098 2.359563 2 276975 3.127 403482 3.107 1.456745 659635 3.098 2.381569 3 256610 3.127 375017 3.107 1.461428 604627 3.098 2.356210 4 272043 3.127 395804 3.107 1.454932 651551 3.098 2.395029 5 272962 3.127 399583 3.107 1.463878 657353 3.098 2.408222 6 255066 3.127 377571 3.107 1.480287 606601 3.103 2.378212 TB 3.127 3.107 1.459278 3.098 2.379801 RSD (%) 0.065 3.167 0.0656 0.933757 4.118 0.065 0.842798
❖ Nhận xét: Kết quả cho thấy RSD của thời gian lưu của chuẩn nội, Ciprofloxacin, Levofloxacin <1% và RSD của tỷ số diện tích pic của mỗi chất phân tích và chuẩn nội < 5%. Như vậy hệ thống đạt yêu cầu cho phép phân tích định lượng các kháng sinh trong nước thải, ứng dụng phân tích mẫu cho kết quả tin cậy.
3.2.4. Khoảng tuyến tính
Để xác định khoảng tuyến tính của đường chuẩn các thí nghiệm được thực hiện các điều kiện sắc ký đã lựa chọn, hỗn hợp kháng sinh CIP, LEV có nồng độ từ 10-500 ng/mL và nồng độ nội chuẩn là 10 ng/mL, phân tích lặp 3 lần. Kết quả trong bảng 3.7 cho thấy trong khoảng nồng độ khảo sát có sự phụ thuộc tuyến tính giữa tỉ số diện tích pic của CIP/IS, LEV/IS với nồng độ kháng sinh thể hiện qua hệ số tương quan R2 >0,9990 cho thấy mức độ tương quan tốt, độ tuyến tính chặt chẽ.
Bảng 3.7. Phương trình hồi quy của CIP và LEV Chất phân tích Phương trình hồi quy Hệ số tương quan R2 Khoảng nồng độ tuyến tính (ng/mL) Ciprofloxacin y = 8,102x + 0,7618 0,9994 10 – 500 Levofloxacin y = 9,605x + 0,0423 0,9992 10 – 500
Hình 3.4.Đồ thị biễu diễn sự phụ thuộc tỉ số diện tích pic (CIP/IS) và nồng
Hình 3.5. Đồ thị biễu diễn sự phụ thuộc tỉ số diện tích pic (LEV/IS) và nồng độ LEV (ng/ml)
❖ Nhận xét: Từ các kết quả trong bảng 3.7 và hình 3.4, 3.5 cho thấy sự phụ thuộc tuyến tính giữa tỉ số diện tích pic của mỗi chất chuẩn/diện tích pic của nội chuẩn và nồng độ kháng sinh. Đường chuẩn hồi quy có dạng thẳng và hệ số tương quan r2 >0,995 chứng tỏ trong khoảng nồng độ khảo sát của cả 2 chất kháng sinh có sự tuyến tính chặt chẽ giữa nồng độ chất phân tích với tỷ lệ diện tích pic của chất phân tích (kháng sinh). Do đó, dựa vào phương trình có thể tính toán kết quả định lượng với độ tin cậy cao.
3.2.5. Giới hạn định lượng (LOQ), giới hạn phát hiện (LOD)
Để xác định LOQ và LOD của phương pháp được thực hiện bằng cách thêm hỗn hợp chuẩn gốc đã được pha loãng vào nền mẫu trắng và các điều kiện sắc ký đã lựa chọn. Dựa vào tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu nền S/N, khi tỷ lệ S/N lớn hơn 10 thì xác định được giá trị của LOQ. Sắc ký đồ thể hiện tín hiệu LOQ của CIP và LEV trên nền mẫu trắng được thể hiện trong hình 3.6 cho thấy khi nồng độ LEV là 0,1 ng/mL và nồng độ CIP là 0,2 ng/mL thì diện tích pic của LEV, CIP đạt mức tỷ lệ giữa tín hiệu và nhiễu nền (S/N) lần lượt là 14,9 và 10,1. Vì vậy giá trị LOQ của LEV và CIP lần lượt là 0,1 ng/mL và 0,2 ng/mL. Giá trị LOD được tính theo công thức LOD = LOQ/3,3, khi đó LOD của LEV và CIP lần lượt là 0,03 ng/mL và 0,06 ng/mL.
Hình 3.6.Sắc ký đồ xác định LOQ của LEV có nồng độ 0,1 ng/mL (trên) và CIP có nồng độ 0,2 ng/mL (dưới)
3.2.6. Độ đúng và độ lặp lại
Độ đúng của phương pháp được tiến hành theo quy trình phân tích trên mẫu thử chứa lượng hoạt chất đã biết. Độ lặp lại của phương pháp được xác định thông qua giá trị độ lệch chuẩn tương đối (RSD) thu được khi phân tích 6 mẫu tự tạo khác nhau. Chúng tôi lựa chọn nồng độ để khảo sát là nồng độ khoảng 40 ng/ml. Tiến hành pha dung dịch chuẩn chứa hỗn hợp 3 kháng sinh có nồng độ chính xác khoảng 40 ng/ml, đem đi xử lý mẫu như mục 3.1.3, sau đó được đem đi phân tích bởi các điều kiện đã chọn. Thực hiện đồng thời 6 mẫu song song, kết quả được trình bày như bảng 3.8.
Bảng 3.8.Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp Nồng độ 30ppb Tỷ số KS/ IS Lượng chuẩn tìm lại (ppb) Tỷ lệ thu hồi (%) TB RSD (%) Ciprofloxacin y = 0,1109x + 0,4672 0.913117 20.67 68.9 71.9 4.72 0.936117 20.96 69.9 0.973694 21.42 71.4 1.009746 21.87 72.9 0.995833 21.69 72.3 1.02263 22.02 73.4 Levofloxacin y = 0,1109x + 0,4672 2.806793 28.78 95.9 101.8 3.98 2.828992 29.01 96.7 2.979554 30.58 101.9 3.017203 30.97 103.2 2.99614 30.75 102.5 3.092564 31.76 105.9
❖ Nhận xét: Theo qui định của FDA, AOAC thì khi phân tích dư lượng kháng sinh trong nước thải, % tìm lại tại khoảng nồng độ 10ppb - 100ppb đạt trong khoảng 60% - 115% (RSD < 15%). Kết quả thu được có độ đúng từ 68,9 – 101,8%, RSD tại mức nồng độ <15% chứng tỏ phương pháp có độ đúng cao, thích hợp để định lượng các kháng sinh này trong nước thải.
3.3. Khảo sát khả năng xử lý CIP, LEV của vật liệu BiOI
3.3.1. Khảo sát lượng chất xúc tác BiOI
Lượng chất xúc tác là một trong những yếu tố có ảnh hưởng nhất định tới quá trình quang xúc tác. Khi tăng khối lượng chất xúc tác sẽ tăng cường khả năng tiếp xúc giữa chất xúc tác với các chất kháng sinh dẫn đến lượng chất kháng sinh bị phân hủy sẽ tăng. Do đó nghiên cứu đặc điểm của quá trình quang xúc tác cần phải khảo sát lượng chất xúc tác cần thiết sử dụng nhằm tối ưu hiệu quả xúc tác. Để đánh giá ảnh hưởng của lượng chất xúc tác BiOI đến quá trình quang xúc tác, các thí nghiệm được đã tiến hành đối với 2 loại kháng sinh CIP, LEV ở nồng độ 2 mg/L; thời gian phản ứng 60 phút với lượng vật liệu BiOI là 0,2; 0,5; 1; 1,5 g/L.
Hình 3.7.Ảnh hưởng của lượng chất xúc tác BiOI đến khả năng phân hủy kháng sinh ciprofloxacin
Hình 3.8.Ảnh hưởng của lượng chất xúc tác BiOI đến khả năng phân hủy
kháng sinh levofloxacin
Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của lượng chất xúc tác BiOI đến khả năng phân hủy các chất kháng sinh CIP và LEV thể hiện trong hình 3.7, 3.8 cho thấy khi tăng hàm lượng xúc tác BiOI từ 0,2 - 1,5 g/L, khả năng phân hủy CIP và LEV tăng. Với lượng BiOI là 1 g/L, tốc độ phản ứng tuy xảy ra chậm hơn so với lượng BiOI 1,5 g/L nhưng khi thời gian phản ứng là 60 phút,
lượng kháng sinh phân hủy gần như hoàn toàn. Do đó các nghiên cứu tiếp theo sẽ chọn lượng xúc tác BiOI tối thiểu vừa đủ là 1 g/L.
3.3.2. Khảo sát nồng độ kháng sinh ban đầu
Trong quá trình quang xúc tác, nồng độ đầu là một yếu tố quan trọng cần phải khảo sát. Nồng độ đầu cao sẽ làm tăng khả năng khuếch tán của các chất kháng sinh trong dung dịch đến bề mặt chất xúc tác dẫn đến tốc độ phân hủy sẽ tăng. Ảnh hưởng của nồng độ kháng sinh ban đầu đến quá trình phân hủy được thực hiện với thời gian phản ứng 60 phút, lượng BiOI là 1 g/L, nồng độ CIP và LEV thay đổi từ 1 - 5 mg/L. Kết quả thể hiện trong hình 3.9, 3.10 cho thấy, khi nồng độ kháng sinh ban đầu tăng từ 1 - 2 mg/L, hiệu suất phân hủy giảm chậm. Khi nồng độ kháng sinh ban đầu tăng lên tới 5 mg/L, hiệu suất xử lý giảm nhanh hơn. Điều này được giải thích là khi nồng độ ban đầu thấp, các trung tâm hoạt động trên bề mặt của BiOI vẫn chưa được lấp đầy bởi các chất kháng sinh nên khả năng phân hủy cao. Nhưng khi tăng nồng độ kháng sinh thì các trung tâm trên đã được che phủ kín thì khả năng phân hủy giảm rất nhanh. Bề mặt chất xúc tác bị bão hòa bởi các chất kháng sinh.
Hình 3.9.Ảnh hưởng của nồng độ kháng sinh CIP ban đầu đến hiệu suất
Hình 3.10. Ảnh hưởng của nồng độ kháng sinh LEV ban đầu đến hiệu suất phân hủy của vật liệu BiOI
3.3.3. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng
Các thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình phân hủy CIP, LEV của vật liệu BiOI được tiến hành ở thời gian phản ứng 60 phút, lượng BiOI 1g/L, nồng độ CIP, LEV ban đầu 1,5 mg/L. Kết quả nghiên cứu được trình bày trong hình 3.11, 3.12.
Hình 3.11. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng phân hủy ciprofloxacin của vật liệu BiOI
Hình 3.12. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng phân hủy levofloxacin
của vật liệu BiOI
Từ hình 3.11-12 có thể thấy khi nhiệt độ tăng từ 25 - 5 °C hiệu suất phân hủy các chất kháng sinh CIP, LEV của vật liệu BiOI có xu hướng tăng nhẹ. Khi nhiệt độ tăng, tốc độ phản ứng tăng, nên khả năng phân hủy CIP, LEV của BiOI tăng. Mặt khác, khi nhiệt độ tăng dẫn đến sự gia tăng quá trình
khuếch tán của CIP, LEV đến bề mặt BiOI làm tăng khả năng tiếp xúc giữa chất xúc tác và chất bị xúc tác.
3.3.4. Khảo sát độ ổn định của chất xúc tác
Các thí nghiệm đánh giá độ ổn định của chất xúc tác BiOI đối với quá trình xử lý đồng thời kháng sinh CIP, LEV trong nước được tiến hành với các điều kiện tối ưu đã lựa chọn ở trên. Vật liệu BiOI sau mỗi lần thử nghiệm khả năng quang xúc tác sẽ được lọc, rửa sạch bằng nước cất và được tiếp tục sử dụng để xử lý dung dịch có chứa hỗn hợp CIP và LEV. Các thí nghiệm được lặp lại 6 lần mẫu Kết quả thể hiện trong hình 3.13 cho thấy sau 6 lần thử nghiệm, hiệu suất phân hủy CIP, LEV của BiOI giảm không đáng kể. Như vậy, có thể thấy rằng hoạt tính quang xúc tác của vật liệu BiOI rất ổn định.
Hình 3.13. Kết quả đánh giá độ ổn định của chất xúc tác BiOI đối với quá
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
1. KẾT LUẬN
- Xây dựng phương pháp phân tích đồng thời kháng sinh Ciprofloxacin và Levofloxacin trong nước thải bằng sắc ký lỏng khối phổ - LC-MS/MS với cột sắc ký C18, thể tích tiêm mẫu là 3 μl, tốc độ dòng 0,3 ml/phút, pha động bao gồm ACN (HCOOH 0,1%) : H2O (HCOOH 0,1%) theo chương trình gradient.
- Thẩm định phương pháp phân tích Ciprofloxacin và Levofloxacin với phương trình hồi quy tuyến tính lần lượt là y = 8,102x + 0,7618 và y = 9,605x + 0,0423. Khoảng tuyến tính 10 - 500 ng/mL. Hệ số tương quan R2 là 0,9994 và 0,9992. Giới hạn phát hiện (LOD) 0,06 ng/mL và 0,03 ng/mL, giới hạn định lượng (LOQ) 0,2 ng/mL và 0,1 ng/mL. Hiệu suất thu hồi (R%) của CIP và LEV lần lượt là 68,9 - 73,4% và 95,9 - 105,9%.
- Đánh giá hiệu quả xử lý kháng sinh Ciprofloxacin và Levofloxacin trong nước bằng vật liệu xúc tác BIOI với các điều kiện tối ưu như lượng vật liệu xúc tác BIOI là 1 g/L; nồng độ kháng sinh Ciprofloxacin và Levofloxacin ban đầu là 1,5 mg/L; nhiệt độ phản ứng là 25oC (nhiệt độ phòng); thời gian phản ứng là 60 phút. Hiệu suất xử lý kháng sinh CIP và LEV đạt tới 98,7 % và 99,1%. Vì vậy, có thể ứng dụng trong xử lý dư lượng kháng sinh trong môi trường nước thải.
2. KIẾN NGHỊ
Tiếp tục nghiên cứu ứng dụng phương pháp phân tích đồng thời các chất kháng sinh bằng LC-MS/MS nhằm xác định dư lượng kháng sinh fluoroquinolon nói riêng và các kháng sinh nói chung trong các mẫu thực phẩm, mẫu nước thải, mẫu tóc, nước tiểu...
TÀI LIỆU THAM KHẢO
[1] E. Y. Klein et al., “Global increase and geographic convergence in
antibiotic consumption between 2000 and 2015,” Proc. Natl. Acad. Sci.
U. S. A., vol. 115, no. 15, pp. E3463–E3470, 2018, doi:
10.1073/pnas.1717295115.
[2] T. P. Van Boeckel et al., “Global antibiotic consumption 2000 to 2010: An analysis of national pharmaceutical sales data,” Lancet Infect. Dis.,
vol. 14, no. 8, pp. 742–750, 2014, doi: 10.1016/S1473-3099(14)70780- 7.
[3] P. Ball, “Quinolone generations: Natural history or natural selection?,”
J. Antimicrob. Chemother., vol. 46, no. TOPIC T1, pp. 17–24, 2000,
doi: 10.1093/oxfordjournals.jac.a020889.
[4] H. Yao, J. Lu, J. Wu, Z. Lu, P. C. Wilson, and Y. Shen, “Adsorption of fluoroquinolone antibiotics by wastewater sludge biochar: role of the sludge source,” Water, Air, Soil Pollut., vol. 224, no. 1, p. 1370, 2013. [5] X. Chang et al., “BiOX (X = Cl, Br, I) photocatalysts prepared using
NaBiO3 as the Bi source: Characterization and catalytic performance,”
Catal. Commun., vol. 11, no. 5, pp. 460–464, 2010, doi:
10.1016/j.catcom.2009.11.023.
[6] Z. Deng, D. Chen, B. Peng, and F. Tang, “From bulk metal Bi to two- dimensional well-crystallized BiOX (X = Cl, Br) micro- and nanostructures: Synthesis and characterization,” Cryst. Growth Des.,
vol. 8, no. 8, pp. 2995–3003, 2008, doi: 10.1021/cg800116m.
[7] X. Xiao and W. De Zhang, “Facile synthesis of nanostructured BiOI microspheres with high visible light-induced photocatalytic activity,” J. Mater. Chem., vol. 20, no. 28, pp. 5866–5870, 2010, doi:
10.1039/c0jm00333f.
[8] R. Hao, X. Xiao, X. Zuo, J. Nan, and W. Zhang, “Efficient adsorption and visible-light photocatalytic degradation of tetracycline hydrochloride using mesoporous BiOI microspheres,” J. Hazard.
Mater., vol. 209–210, pp. 137–145, 2012, doi:
10.1016/j.jhazmat.2012.01.006.
[9] S. Heidari, M. Haghighi, and M. Shabani, “Sunlight-activated BiOCl/BiOBr–Bi24O31Br10 photocatalyst for the removal of pharmaceutical compounds,” J. Clean. Prod., vol. 259, p. 120679, 2020, doi: 10.1016/j.jclepro.2020.120679.
[10] Nguyễn Thị Thanh Nga, “Nghiên cứu qui trình xác định dư lượng ciprofloxacin và enprofloxacin trong thực phẩm bằng phương pháp hplc-ms/ms,” Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh, 2009.
[11] SUNU, “WHO list of critically important antimicrobials for human medicine (WHO CIA list),” World Heal. Organ., p. 5th revision, 2017,
[Online]. Available:
[12] D. M. Livermore, A. P. Macgowan, and M. C. J. Wale, Surveillance of
antimicrobial resistance, vol. 317, no. 7159. 1998.
[13] F. d. A. Rodrigues and A. D. Bertoldi, “The profile of antimicrobial utilization in a private hospital,” Cienc. e Saude Coletiva, vol. 15, no.
SUPPL. 1, pp. 1239–1247, 2010, doi: 10.1590/s1413- 81232010000700033.
[14] “Phân tích thực trạng sử dụng kháng sinh và kháng kháng sinh tại Việt Nam, 2010 (Situation Analysis on Antibiotic Use and Resistance in Vietnam, 2010, GARP – Việt Nam).”
[15] “Báo cáo sử dụng kháng sinh và kháng kháng sinh tại 15 bệnh viện Việt Nam năm 2008-2009 (Report on AB use and resistance in 15 hospitals in Vietnam 2008-2009).”
[16] K. Kothekar, B. Jayakar, A. Khandhar, and R. Mishra, “Quantitative