3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
3.2. Kết quả phân lập vi khuẩn Salmonella
3.2.1. Kết quả phân lập vi khuẩn Salmonella từ các mẫu phân và bệnh phẩm
Mầm bệnh sau khi nhiễm vào đường tiêu hóa, đặc biệt là ở ruột non và kết tràng, chúng nhanh chóng đi vào hệ lâm ba của ruột gây viêm sưng hạch, từ đó vào hệ tuần hoàn, gây bại huyết, ở đây chúng sản sinh độc tố làm tổn thương gan và lách. Trên cơ sở đó, để tìm hiểu vai trò gây bệnh của vi khuẩn Salmonella gây bệnh thương hàn ở gà, chúng tôi đã tiến hành nuôi cấy phân lập vi khuẩn
Salmonella từ mẫu phân của gà và bệnh phẩm gồm: máu, gan, lách, manh tràng của các gà ở 3 xã của huyện Tam Dương. Sau khi thu thập mẫu thí nghiệm được xử lý, nuôi cấy và phân lập tại Trạm chẩn đoán, xét nghiệm, Chi cục Chăn nuôi và Thú y Vĩnh Phúc. Kết quả phân lập được trình bày ở bảng 3.7 và hình 3.6.
Bảng 3.7. Kết quả phân lập vi khuẩn Salmonella spp. từ các mẫu phân và bệnh phẩm TT Địa điểm (xã) Số mẫu kiểm tra Số mẫu dương tính Tỷ lệ (%) 1 Thanh Vân 50 15 30,00 2 Duy Phiên 50 12 24,00 3 Kim Long 50 8 16,00 Tính chung 150 35 23,33
30,00 24,00 16,00 0 5 10 15 20 25 30
Thanh Vân Duy Phiên Kim Long Tỷ lệ (%)
Địa
phương
Hình 3.6. Biểu đồ kết quả phân lập vi khuẩn Salmonella spp. từ các mẫu phân và bệnh phẩm
Bảng 3.7 và hình 3.6 cho thấy: trong tổng số 150 mẫu phân và phủ tạng thu thập được, có 35 mẫu đã phân lập được vi khuẩn Salmonella, chiếm tỷ lệ trung bình là (23,33%). Tỷ lệ phân lập được Salmonella cao nhất ở các mẫu lấy từ xã Thanh Vân (30%), tiếp đến là xã Duy Phiên (24%) và thấp nhất là ở xã Kim Long (16%).
Theo chúng tôi, sự khác nhau này có thể do rất nhiều nguyên nhân như thức ăn, chuồng trại, điều kiện chăm sóc nuôi dưỡng; do các vùng địa lý nghiên cứu khác nhau, thời điểm lấy mẫu khác nhau... Kết quả nghiên cứu này tiếp tục khẳng định vai trò của vi khuẩn Salmonella trong bệnh thương hàn của gà. Vấn đề do Salmonella và bệnh do chúng gây ra đã được thế giới khẳng định từ thế kỷ 18, song đến nay nó vẫn còn nguyên giá trị, thậm chí ngày càng trở lên phức tạp hơn. Bởi vậy, những nghiên cứu này vẫn là vấn đề cần thiết đối với mỗi quốc gia.
Kết quả phân lập vi khuẩn Salmonella trên gà có ý nghĩa rất quan trọng trong chẩn đoán, cho phép xác định bệnh và có biện pháp nhanh chóng trong phòng trị bệnh do vi khuẩn Salmonella gây ra nhằm giảm thiệt hại trong chăn nuôi, đặc biệt là trong chăn nuôi gà. Việc tìm thấy vi khuẩn Salmonella hay không trong mẫu nghiên cứu còn phụ thuộc vào quá trình sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi gà để phòng trị bệnh. Sử dụng kháng sinh không thích hợp, cũng như không đúng liệu trình sẽ ảnh hưởng đến quá trình lây lan cũng như thời gian thải vi khuẩn Salmonella ở gà.
Theo nguyên tắc chung để khống chế và phòng chống các bệnh truyền nhiễm có hiệu quả thì điều kiện tiên quyết là chúng ta phải xác định được chính xác tác nhân gây bệnh, phải nắm được đầy đủ bản chất của mầm bệnh. Phải hiểu được tính gây bệnh của mầm bệnh theo mùa vụ trong năm đối với động vật nghiên cứu. Theo Nguyễn Như Thanh và cs (2001), Nguyễn Quang Tuyên (2008) trong điều kiện bình thường Salmonella có trong đường ruột của người và động vật khỏe. Trong trường hợp sức đề kháng của cơ thể tốt, hệ vi sinh vật ở trạng thái cân bằng thì bệnh không xảy ra. Khi điều kiện chăm sóc, quản lý kém làm cho sức đề kháng của con vật giảm thì Salmonella xâm nhập vào nội tạng gây bệnh. Kết quả xác định tỷ lệ nhiễm Salmonella trên gà thể hiện rõ hơn ở hình 3.6.
3.2.2. Kết quả xác định tỷ lệ phân lập vi khuẩn Salmonella spp ở một số cơquan phủ tạng của gà bệnh quan phủ tạng của gà bệnh
Qua mẫu bệnh phẩm của gà mắc bệnh, chúng tôi có thể xác định được tỷ lệ nhiễm vi khuẩn Salmonella. Ngoài ra chúng ta cón có thể biết được những tác hại và tổn thương do vi khuẩn gây ra ở bệnh phẩm từ đó ta có thể chẩn đoán xác định được vi khuẩn gây bệnh ở gia cầm.
Để tiến hành xác định tỷ lệ nhiễm Salmonella, chúng tôi tiến hành lấy mẫu gan, lách, ruột và phân của gà chết nghi mắc bệnh thương thu thập ở 3 xã của huyện Tam Dương. Kết quả được trình bày ở bảng 3.8 và hình 3.7.
Bảng 3.8. Kết quả xác định tỷ lệ nhiễm vi khuẩn Salmonella spp.
ở bệnh phẩm
Loại bệnh phẩm Số mẫu kiểm tra Số mẫu dương tính Tỷ lệ nhiễm (%)
Gan 25 3 12,00 Lách 25 7 28,00 Manh tràng 25 11 44,00 Tính chung 75 21 28,00 12,00 28,00 44,00 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Gan Lách Manh tràng (Tỷ lệ %) Bệnh phẩm
Hình 3.7. Biểu đồ kết quả xác định tỷ lệ nhiễm vi khuẩn Salmonella spp. ở bệnh phẩm
Bảng 3.8 và hình 3.7 cho thấy với tổng số 75 mẫu cơ quan nội tạng của gà đã thu thập ở 3 xã tại huyện Tam Dương có 21 mẫu phân lập được
Salmonella, chiếm tỷ lệ 28%. Trong đó có 11/25 mẫu phân lập được
Salmonella ở manh tràng, chiếm tỷ lệ cao nhất 44%, sau đó là mẫu bệnh phẩm ở lách 7/25 chiếm tỷ lệ là 28%, thấp nhất là ở mẫu bệnh phẩm ở gan 3/25 chiếm tỷ lệ 12%.
Với kết quả phân lập Salmonella từ các nguồn bệnh phẩm như manh tràng, lách, gan của gà mang trùng Salmonella, ở gà bệnh. Khi gà nhiễm bệnh, vi khuẩn Salmonella thường cư trú ở phần lớn nội tạng của gà bệnh như: gan,
lách, manh tràng, đặc biệt là ở trong manh tràng thì tỷ lệ Salmonella là cao nhất. Vì Salmonella là vi khuẩn thường trực ở đường ruột nên manh tràng thường có Salmonella và khi cơ thể giảm sức đề kháng hoặc nhiễm các bệnh khác thì Salmonella càng có điều kiện phát triển và gây bệnh cho vật nuôi.
3.3. Kết quả giám định một số đặc tính nuôi cấy và định danh các chủng
Salmonella phân lập
Mỗi loài vi khuẩn có một đặc tính sinh học khác nhau như tính chất nuôi cấy trên các môi trường thông thường, môi trường đặc hiệu, đặc tính chuyển hoá các loại đường và khả năng sản sinh các hợp chất sinh học trung gian trên các môi trường nuôi cấy.
Để khẳng định các chủng vi khuẩn phân lập được có phải là Salmonella
hay không, chúng tôi đã tiến hành giám định một số đặc tính nuôi cấy của chúng trên các môi trường: BPW, RV, thạch DHL, Thạch CHROM™
Salmonella, thạch TSI, thạch LIM và môi trường Malonate. Kết quả được trình bày ở bảng 3.9.
Bảng 3.9. Kết quả giám định một sốđặc tính nuôi cấy và định danh các chủng Salmonella phân lập Chỉ tiêu kiểm tra Số chủng Đặc điểm Kết quả Tỷ lệ (%) BPW 35 Mọc tốt, đục đều 35 100,0
RV 35 Mọc tốt, làm nhạt màu môi trường 35 100,0
Thạch DHL 35
Khuẩn lạc ở giữa đen, xung quanh trong suốt, hoặc khuẩn lạc trong suốt không màu, dạng s
35 100,0 Thạch CHROMTM 35 Khuẩn lạc có màu tím hồng, dạng S 35 100,0
Thạch TSI 35
Phần môi trường mặt nghiêng có màu đỏ; dưới đáy có màu vàng; phần giữa có màu đen, có sinh hơi hoặc không sinh hơi
35 100,0
Thạch LIM 35 Môi trường có màu tím 35 100,0
Kết quả ở bảng 3.9 cho thấy:
- 100% số chủng vi khuẩn khi nuôi cấy vào môi trường tăng sinh như BPW, RV đều mọc rất tốt, chúng làm đục môi trường, dưới đáy ống nghiệm có cặn, sau 24 giờ mặt môi trường có màng mỏng.
- 100% số chủng vi khuẩn khi nuôi cấy trên môi trường thạch DHL tạo khuẩn lạc ở giữa màu đen, xung quanh trong suốt hoặc khuẩn lạc trong suốt không màu. Trên môi trường thạch CHROM™ Salmonella, khuẩn lạc có màu tím hồng, dạng S.
- Tất cả 35 chủng Salmonella đều mọc và phát triển tốt trên môi trường TSI, có hoặc không sản sinh H2S.
- Tất cả các chủng không chuyển màu môi trường thạch LIM (môi trường LIM vẫn có màu tím), có nghĩa là dương tính đối với phản ứng Lysine.
- 100% số chủng không làm chuyển màu môi trường Malonate.
Sau khi tiến hành kiểm tra đều thu được tính chất đặc trưng của vi khuẩn
Salmonella. H2S (+) làm cho thạch Kligler chuyển từ màu đỏ sang màu đen, môi trường Simmon’s citrate (+) làm đổi màu môi trường từ màu xanh lá cây sang màu xanh nước biển, urease (-) giữ nguyên màu vàng chanh của môi trường, lysine (-) giữ nguyên màu tím của môi trường; 100% có phản ứng dương tính với catalaza và Simmon’s citrate, 20/35 lên men sinh hơi chiếm 57,14%; 100% số chủng kiểm tra không phân giải ure và lysine; 100% số chủng kiểm tra không có phản ứng với oxydaza. Các chủng Salmonella sinh hơi làm phần thạch bị đẩy lên từ phía dưới ống nghiệm.
3.4. Kết quả xác định một số đặc tính sinh hóa của vi khuẩn Salmonella
phân lập được
Sau khi xác định đặc tính nuôi cấy của các chủng vi khuẩn Salmonella
trên, chúng tôi đã tiến hành kiểm tra một số đặc tính sinh hóa của chúng. Kết quả được trình bày ở bảng 3.10.
Bảng 3.10. Kết quả xác định một sốđặc tính sinh hóa của các chủng
Salmonella phân lập được TT Các chỉ tiêu kiểm tra Số mẫu kiểm tra Số mẫu dương tính Tỷ lệ (%) 1 Sinh hơi 35 20 57,14 2 Catalaza 35 35 100 3 Oxydaza 35 0 0 4 Lysine 35 0 0 5 Phản ứng sinh H2S 35 35 100 6 Phản ứng sinh Indol 35 0 0
7 Phân giải Ure 35 0 0
8 Simmons citrate 35 35 100 9 Lactose 35 0 0 10 Glucose 35 35 100 11 Mantolse 35 29 82,86 12 Galactose 35 35 100 13 Manitolse 35 35 100 14 Saccarrose 35 0 0
Kết quả ở bảng 3.10. cho thấy: 100% số chủng Salmonella phân lập được không lên men lactose và saccarrose. 100% số chủng lên men glucose, galactose, manitolse và có 29/35 số chủng Salmonella phân lập được lên men mantolse chiếm 82,86%; vi khuẩn lên men glucose làm mặt thạch nghiêng có màu vàng.
Kết quả nghiên cứu cho thấy tất cả các chủng Salmonella phân lập được đều lên men glucose nhưng chỉ có 57,14% số chủng có khả năng sinh hơi. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi khá tương đồng với các tài liệu kinh điển cho thấy đa phần các chủng Salmonella đều lên men glucose, 100% không lên men lactose, đa số có khả năng sinh H2S.
Như vậy, đặc tính sinh vật hoá học của các chủng Salmonella phân lập được mang đặc điểm chung của giống Salmonella và phù hợp với những đặc điểm về hình thái, nuôi cấy, đặc tính sinh hoá của vi khuẩn này theo như mô tả của tác giả Nguyễn Quang Tuyên (2008) khi nghiên cứu về vi khuẩn Salmonella.
3.5. Kết quả xác định độc lực của vi khuẩn Salmonella gallinarum pullorum3.5.1. Kết quả xác định độc lực của vi khuẩn Salmonella gallinarum 3.5.1. Kết quả xác định độc lực của vi khuẩn Salmonella gallinarum pullorum phân lập được bằng phản ứng PCR
Khả năng gây bệnh của vi khuẩn được căn cứ vào độc lực và khả năng sản sinh độc tố. Có rất nhiều phương pháp để xác định độc lực của vi khuẩn
Salmonella nhưng phương pháp hiện đại và ưu việt nhất hiện nay là dùng phản ứng PCR.
Vi khuẩn có sẵn những yếu tố gây bệnh thì khả năng kháng kháng sinh sẽ làm tăng tính gây bệnh của vi khuẩn lên gấp bội. Vì vậy để xác định một số yếu tố gây bệnh của các chủng vi khuẩn Salmonella phân lập được, chúng tôi đã tiến hành xác định khả năng sản sinh độc tố, yếu tố xâm nhập và khả năng kháng kháng sinh của chúng.
Độc tố đường ruột do vi khuẩn Salmonella sản sinh ra có 2 thành phần: độc tố thẩm xuất nhanh (Rapid Difution Factor- RDF) có cấu trúc thành phần hoạt tính giống với độc tố chịu nhiệt của vi khuẩn E. coli nên phần lớn các tác giả còn gọi là độc tố chịu nhiệt ST (Heat Stabile Toxin); Độc tố thẩm xuất chậm có cấu trúc, thành phần hoạt tính giống độc tố không chịu nhiệt của vi khuẩn E. coli nên thường gọi là độc tố không chịu nhiệt LT (Heat Labile Toxin). Ngoài ra, yếu tố kháng kháng sinh cũng đóng vai trò hết sức quan trọng trong quá trình sinh bệnh của vi khuẩn Salmonella.
Khả năng gây bệnh của vi khuẩn Salmonella ở động vật thường bắt đầu bằng khả năng bám dính của vi khuẩn lên các receptor trên niêm mạc ruột. Sau đó, vi khuẩn xâm nhập vào tế bào biểu mô ruột nhờ các yếu tố xâm nhập có trong cấu trúc của vi khuẩn và giải phóng độc tố. Độc tố đường ruột (Enterotoxin) là yếu tố quan trọng nhất quyết định sinh bệnh lý tiêu chảy cho gia súc, gia cầm.
Có rất nhiều phương pháp để xác định độc tố đường ruột (enterotoxin), khả năng xâm nhập (invasion) và khả năng kháng kháng sinh (definitive phage type 104) của Salmonella, tuy nhiên phương pháp ưu việt nhất hiện nay được áp dụng rộng rãi trong và ngoài nước để nghiên cứu vi khuẩn
Salmonella là phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction). Ưu điểm của phương pháp này là độ nhạy và độ đặc hiệu cao, có thể thực hiện với số lượng mẫu lớn và cho kết quả nhanh, chính xác trong thời gian ngắn.
Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã sử dụng phương pháp PCR để xác định một số yếu tố độc lực của vi khuẩn Salmonella. Các cặp mồi mà chúng tôi sử dụng cho phản ứng PCR để xác định một số yếu tố độc lực của các chủng vi khuẩn Salmonella là: Stn-F và Stn-R dùng để xác định gen sản sinh độc tố đường ruột Stn (cho kích cỡ sản phẩm là 259 bp), InvA-F và InvA-R để xác định gen quyết định yếu tố xâm nhập InvA (cho sản phẩm là 521 bp), 104SR-F và 104SR-R dùng để xác định gen kháng kháng sinh DT104 (cho sản phẩm là 162 bp). Các bước tiến hành phản ứng PCR như đã mô tả ở phần nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu.
Bảng 3.11. Kết quả xác định yếu tố gây bệnh của Salmonella gallinarum pullorum bằng phản ứng PCR Số TT Serotype Số chủng kiểm tra Yếu tố gây bệnh Stn InvA DT104 (+) % (+) % (+) % 1 S. gallinarum 9 9 100 9 100 0 0 2 S. pullorum 11 11 100 11 100 0 0 Tính chung 20 20 100 20 100 0 0
Kết quả sản phẩm nhân gen được điện di trên gel agarose 1,5% cho kết quả như sau:
1. Gen Stn:
M: Ladder 100bp, (+): Chứng dương, (-): Chứng âm, 1-5: Mâu thí nghiệm
2. Gen InvA:
M: Ladder 100bp, (+): Chứng dương, (-): Chứng âm, 1-6: Mẫu xét nghiệm
3. Gen DT104: Không xuất hiện gen DT104 trong các mẫu xét nghiệm
M ac ke r 500bp 259bp (+) (-) 1 2 3 4 5
Qua bảng 3.11 cho thấy: Trong tổng số 20 chủng Salmonella được kiểm tra, có 20 chủng mang gen Stn (chiếm tỷ lệ 100%), 20 chủng mang gen InvA (chiếm 100%) và không có chủng nào mang yếu tố DT104.
Từ kết quả này cho thấy: 100% các chủng Salmonella có khả năng sản sinh độc tố đường ruột và đều mang yếu tố xâm nhập nhưng không có gen quy đinh kháng kháng sinh DT104. Khả năng xâm nhập vào các tế bào có nhân, vào lớp niêm mạc đường ruột là đặc tính của một số chủng Salmonella
có độc lực, còn các biến chủng Salmonella không có khả năng xâm nhập vào tế bào thường là các chủng không có độc lực.
Từ các kết quả này, có thể sơ bộ kết luận: Các chủng vi khuẩn kiểm tra phân lập được trong nghiên cứu này đều có mang những yếu tố độc lực cần thiết tham gia vào quá trình gây bệnh ở gia cầm.
3.5.2. Kết quả xác định độc lực của vi khuẩn Salmonella gallinarum pullorum phân lập được pullorum phân lập được
Vi khuẩn Salmonella có rất nhiều serotyp, độc lực của mỗi serotyp lại phụ thuộc vào yếu tố gây bệnh. Ở mỗi serotyp, các yếu tố gây bệnh sẽ quyết định thể bệnh cấp tính hoặc mãn tính. Do vậy, chúng tôi đã tiến hành kiểm tra độc lực của các chủng Salmonella phân lập được trên chuột nhắt trắng.
Từ 20 chủng Salmonella gallinarum pullorum phân lập được có yếu tố gây bệnh, chọn ngẫu 3 chủng để thử độc lực bằng cách tiêm truyền qua chuột nhắt trắng. Các chủng nuôi cấy trong môi trường BHI trong bình tam giác