3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
3.5. Kết quả xác định độc lực của vi khuẩn Salmonella gallinarum
pullorum phân lập được bằng phản ứng PCR
Khả năng gây bệnh của vi khuẩn được căn cứ vào độc lực và khả năng sản sinh độc tố. Có rất nhiều phương pháp để xác định độc lực của vi khuẩn
Salmonella nhưng phương pháp hiện đại và ưu việt nhất hiện nay là dùng phản ứng PCR.
Vi khuẩn có sẵn những yếu tố gây bệnh thì khả năng kháng kháng sinh sẽ làm tăng tính gây bệnh của vi khuẩn lên gấp bội. Vì vậy để xác định một số yếu tố gây bệnh của các chủng vi khuẩn Salmonella phân lập được, chúng tôi đã tiến hành xác định khả năng sản sinh độc tố, yếu tố xâm nhập và khả năng kháng kháng sinh của chúng.
Độc tố đường ruột do vi khuẩn Salmonella sản sinh ra có 2 thành phần: độc tố thẩm xuất nhanh (Rapid Difution Factor- RDF) có cấu trúc thành phần hoạt tính giống với độc tố chịu nhiệt của vi khuẩn E. coli nên phần lớn các tác giả còn gọi là độc tố chịu nhiệt ST (Heat Stabile Toxin); Độc tố thẩm xuất chậm có cấu trúc, thành phần hoạt tính giống độc tố không chịu nhiệt của vi khuẩn E. coli nên thường gọi là độc tố không chịu nhiệt LT (Heat Labile Toxin). Ngoài ra, yếu tố kháng kháng sinh cũng đóng vai trò hết sức quan trọng trong quá trình sinh bệnh của vi khuẩn Salmonella.
Khả năng gây bệnh của vi khuẩn Salmonella ở động vật thường bắt đầu bằng khả năng bám dính của vi khuẩn lên các receptor trên niêm mạc ruột. Sau đó, vi khuẩn xâm nhập vào tế bào biểu mô ruột nhờ các yếu tố xâm nhập có trong cấu trúc của vi khuẩn và giải phóng độc tố. Độc tố đường ruột (Enterotoxin) là yếu tố quan trọng nhất quyết định sinh bệnh lý tiêu chảy cho gia súc, gia cầm.
Có rất nhiều phương pháp để xác định độc tố đường ruột (enterotoxin), khả năng xâm nhập (invasion) và khả năng kháng kháng sinh (definitive phage type 104) của Salmonella, tuy nhiên phương pháp ưu việt nhất hiện nay được áp dụng rộng rãi trong và ngoài nước để nghiên cứu vi khuẩn
Salmonella là phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction). Ưu điểm của phương pháp này là độ nhạy và độ đặc hiệu cao, có thể thực hiện với số lượng mẫu lớn và cho kết quả nhanh, chính xác trong thời gian ngắn.
Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã sử dụng phương pháp PCR để xác định một số yếu tố độc lực của vi khuẩn Salmonella. Các cặp mồi mà chúng tôi sử dụng cho phản ứng PCR để xác định một số yếu tố độc lực của các chủng vi khuẩn Salmonella là: Stn-F và Stn-R dùng để xác định gen sản sinh độc tố đường ruột Stn (cho kích cỡ sản phẩm là 259 bp), InvA-F và InvA-R để xác định gen quyết định yếu tố xâm nhập InvA (cho sản phẩm là 521 bp), 104SR-F và 104SR-R dùng để xác định gen kháng kháng sinh DT104 (cho sản phẩm là 162 bp). Các bước tiến hành phản ứng PCR như đã mô tả ở phần nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu.
Bảng 3.11. Kết quả xác định yếu tố gây bệnh của Salmonella gallinarum pullorum bằng phản ứng PCR Số TT Serotype Số chủng kiểm tra Yếu tố gây bệnh Stn InvA DT104 (+) % (+) % (+) % 1 S. gallinarum 9 9 100 9 100 0 0 2 S. pullorum 11 11 100 11 100 0 0 Tính chung 20 20 100 20 100 0 0
Kết quả sản phẩm nhân gen được điện di trên gel agarose 1,5% cho kết quả như sau:
1. Gen Stn:
M: Ladder 100bp, (+): Chứng dương, (-): Chứng âm, 1-5: Mâu thí nghiệm
2. Gen InvA:
M: Ladder 100bp, (+): Chứng dương, (-): Chứng âm, 1-6: Mẫu xét nghiệm
3. Gen DT104: Không xuất hiện gen DT104 trong các mẫu xét nghiệm
M ac ke r 500bp 259bp (+) (-) 1 2 3 4 5
Qua bảng 3.11 cho thấy: Trong tổng số 20 chủng Salmonella được kiểm tra, có 20 chủng mang gen Stn (chiếm tỷ lệ 100%), 20 chủng mang gen InvA (chiếm 100%) và không có chủng nào mang yếu tố DT104.
Từ kết quả này cho thấy: 100% các chủng Salmonella có khả năng sản sinh độc tố đường ruột và đều mang yếu tố xâm nhập nhưng không có gen quy đinh kháng kháng sinh DT104. Khả năng xâm nhập vào các tế bào có nhân, vào lớp niêm mạc đường ruột là đặc tính của một số chủng Salmonella
có độc lực, còn các biến chủng Salmonella không có khả năng xâm nhập vào tế bào thường là các chủng không có độc lực.
Từ các kết quả này, có thể sơ bộ kết luận: Các chủng vi khuẩn kiểm tra phân lập được trong nghiên cứu này đều có mang những yếu tố độc lực cần thiết tham gia vào quá trình gây bệnh ở gia cầm.
3.5.2. Kết quả xác định độc lực của vi khuẩn Salmonella gallinarum pullorum phân lập được pullorum phân lập được
Vi khuẩn Salmonella có rất nhiều serotyp, độc lực của mỗi serotyp lại phụ thuộc vào yếu tố gây bệnh. Ở mỗi serotyp, các yếu tố gây bệnh sẽ quyết định thể bệnh cấp tính hoặc mãn tính. Do vậy, chúng tôi đã tiến hành kiểm tra độc lực của các chủng Salmonella phân lập được trên chuột nhắt trắng.
Từ 20 chủng Salmonella gallinarum pullorum phân lập được có yếu tố gây bệnh, chọn ngẫu 3 chủng để thử độc lực bằng cách tiêm truyền qua chuột nhắt trắng. Các chủng nuôi cấy trong môi trường BHI trong bình tam giác 100ml, sau đó canh trùng được bồi dưỡng ở 37oC trong 24 giờ, đếm số lượng vi khuẩn có trong 1 ml canh trùng bằng phương pháp đếm số lượng khuẩn lạc trên thạch.
Mỗi chủng tiêm cho 2 chuột, mỗi chuột 0,2 ml (~ 4 x 107 vi khuẩn) canh trùng vào phúc xoang, theo phương pháp Carter và Sminth (1967). Theo dõi số chuột chết và thời gian chuột chết ở mỗi chủng, mổ khám bệnh tích và phân lập vi khuẩn. Kết quả trình bày ở bảng 3.12.
Bảng 3.12: Kết quả kiểm tra độc lực của một số chủng vi khuẩn
Salmonella gallinarum pullorum trên chuột nhắt trắng Ký hiệu chủng Số chuột tiêm (con) Liều tiêm (ml) Đường tiêm Số chuột chết (con) Tỷ lệ (%) Thời gian chết (giờ) Phân lập lại VK GMlt 2 0,2 Xoang phúc mạc 1 50 <8 + 1 50 20 + GM2 2 0,2 2 100 <8 + GMlb 2 0,2 2 100 20 +
Qua bảng 3.12 cho thấy với 3 chủng xác định độc lực thì cả 3 chủng đều có độc lực cao, gây chết từ 50% đến 100% số chuột, chuột chủ yếu chết trước 20 giờ sau khi tiêm canh trùng chiếm tỷ lệ 100%.
Trong số 3 chủng Salmonella gallinarum pullorum có độc lực có 1 chủng GM2 có độc lực rất mạnh gây chết 100% chuột nhắt trắng, chuột chết trước 8 giờ sau khi tiêm canh trùng chiếm tỷ lệ 33,33% và có 2 chủng GMlt, GMlb Salmonella gallinarum pullorum độc lực mạnh gây chết chuột 100% tập trung vào thời gian 8-20 giờ chiếm tỷ lệ 66,67%.
Kết quả của chúng tôi cũng tương đồng với kết quả Phạm Thị Ngọc và cs (2016). Tác giả đã lấy 50/250 chủng vi khuẩn Salmonella phân lập được tiến hành thử độc lực đã cho kết quả 100% chủng có độc lực cao gây chết chuột thí nghiệm tại thời điểm trước 24 giờ sau khi tiêm.
Trần Thị Hạnh, Đỗ Trung Cứ (2003) đã thử độc lực các chủng
Salmonella phân lập được trên gà và cho biết trong vòng 24 giờ sau khi tiêm cũng cho thấy tất cả các chuột thí nghiệm đều bị chết, trong đó 2 chủng S. enteritidis phân lập từ gà làm chuột chết sau 8 giờ tiêm. Đa phần chuột chết mổ khám bệnh tích thấy gan, lách, thận sưng nhão, có nhiều điểm xuất huyết, dạ dày xuất huyết, ruột đầy hơi, xung quanh chỗ tiêm thủy thũng, nhầy đúng với bệnh tích đặc trưng do Salmonella gallinarum pullorum gây ra.
3.6. Đánh giá tác dụng của bộ chế phẩm NanoSan đến khả năng phòng bệnh thương hàn ở gà
Để đánh giá mức độ ảnh hưởng của việc bổ sung chế phẩm NanoSan có tác dụng như thế nào đến tỷ lệ nuôi sống và phòng bệnh thương hàn ở gà, chúng tôi tiến hành theo dõi gà thí nghiệm, tỷ lệ mắc bệnh Salmonellosis và sự biến động số lượng vi khuẩn Salmonella trong phân và chất độn chuồng của đàn gà thí nghiệm. Kết quả thu được như sau:
3.6.1. Tác dụng của chế phẩm NanoSan đến tỷ lệ nuôi sống và phòng bệnh thương hàn ở gà thương hàn ở gà
Tỷ lệ nuôi sống của gà thí nghiệm ảnh hưởng trực tiếp đến hiệu quả chăn nuôi, bởi sức sống của gia cầm là một tính trạng di truyền số lượng, nó đặc trưng cho từng cá thể và được xác định bởi khả năng chống chịu bệnh tật, khả năng thích nghi với điều kiện môi trường sống thể hiện ở tỷ lệ nuôi sống qua các tuần tuổi. Kết quả được trình bày ở bảng 3.13.
Bảng 3.13. Tác dụng của bộ chế phẩm NanoSan đến khả năng phòng bệnh thương hàn ở gà
Lô TN
Chỉ tiêu Lô I Lô II Lô III Lô IV P
Số con đầu kỳ 150 150 150 150
Số con cuối kỳ 142 145 147 150
Tỷ lệ nuôi sống (%) 94,67b 96,67ab 98,00ab 100,00a 0,006
Số gà mắc bệnh (con) 10 8 6 2
Tỷ lệ gà mắc bệnh (%) 6,67a 5,33a 4,00ab 1,33b 0,009
Ghi chú: Theo hàng ngang, các số mang chữ cái khác nhau thì sai khác nhau có ý nghĩa thống kê với P < 0,05.
94,67 6,67 96,67 5,33 98,00 4,00 100 1,33 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Lô I Lô II Lô III Lô IV
Tỷ lệ nuôi sống (%) Tỷ lệ gà mắc bệnh (%) (Tỷ lệ %) Lô thí nghiệm Hình 3.8. Biểu đồ tác dụng của bộ chế phẩm NanoSan đến tỷ lệ gà nuôi sống và tỷ lệ gà mắc bệnh thương hàn
Qua các số liệu ghi chép tình hình diễn biến số đầu gà qua các tuần tuổi chúng tôi tính được tỷ lệ nuôi sống như trình bày ở bảng 3.13 và biểu đồ hình 3.9. Kết quả cho thấy có sự khác biệt về tỷ lệ nuôi sống ở gà giữa các lô thí nghiệm (P = 0,006), tỷ lệ nuôi sống cao nhất ở lô IV là 100%; tiếp đến lô III là 98%; lô II là 96,67% và thấp nhất ở lô I là 94,67%. Tỷ lệ gà mắc bệnh Lô I cao nhất là 6,67%; sau đó đến lô II là 5,33%; lô III là 4,00% và thấp nhất ở lô 4 là 1,33%. Sự khác nhau về tỷ lệ mắc bệnh giữa các lô thí nghiệm có ý nghĩa thống kê với P = 0,009.
Như vậy, bổ sung bộ chế phẩm NanoSan vào quy trình chăn nuôi gà thí nghiệm có hiệu quả trong việc phòng bệnh thương hàn ở gà. Kết quả của chúng tôi phù hợp với nghiên cứu (Sekhon, 2014). Các hạt Nano bạc được biết đến như là loại sát khuẩn được sử dụng trong chăn nuôi gà. Một thí nghiệm khác đối với hạt nano Mn rất thành công trong loại bỏ độc tố nấm
mốc trong thức ăn bằng việc sử dụng các kháng thể đơn dòng. Nano kim loại bạc được sử dụng trong khẩu phần dinh dưỡng gia cầm ảnh hưởng tích cực tới quần thể vi sinh vật mà không gây ra sự đối kháng vi sinh vật. Đáng chú ý nhất là những nghiên cứu sử dụng bạc (Ag) ở dạng Nano ( kích cỡ dưới 100 nm ) hoặc siêu phân tán ( kích cỡ vài trăm nm ) đã cho thấy kết quả rất khả quan như khả năng kiểm soát khu hệ sinh vật ruột và cải thiện hệ sinh thái vi sinh vật theo hướng có lợi cho vật chủ ( Lok và cs., 2006; Atiyeh và cs., 2007); nâng cao năng suất sinh trưởng ( Andi và cs., 2011)
3.6.2. Kết quả theo dõi số lượng vi khuẩn chỉ điểm (Salmonella) trong phân gà và chất độn chuồng giữa các lô thí nghiệm gà và chất độn chuồng giữa các lô thí nghiệm
Để đánh giá tác dụng của các chế phẩm về phương diện vi sinh vật một cách chi tiết và đầy đủ hơn. Chúng tôi sử dụng các loại vi khuẩn chỉ báo phổ biến đối với bệnh gia cầm là Salmonella... bằng cách theo dõi số lượng vi khuẩn ở các lô thí nghiệm. Mẫu được thu thập tại 04 lô, trung bình 01 tháng kiểm tra 01 lần, tổng số mẫu kiểm tra là 40 mẫu gộp. Kết quả được trình bày ở bảng 3.14.
Bảng 3.14. Số lượng vi khuẩn chỉ điểm (Salmonella)
trong phân gà và chất độn chuồng giữa các lô thí nghiệm Lô TN
Thời gian
Số lượng Salmonella spp/1g phân
Lô I Lô II Lô III Lô IV Lần I (18/7/2019) 4.0 x 104 15.4 x 104 1.4 104 25.5 x 103 Lần II (18/8/2019) 3.5 x 105 6.7 x 104 27 x 103 1.61 x 103 Lần III (18/9/2019) 3.1 x 105 45 x 104 2.3 x 103 0.92 x 103 Lần IV (16/10/2019) 4.3 x 105 37 x 104 1.9 x 103 0.54 x 103 Lần V (18/11/2019) 2.3 x 105 21.6 x 104 0.92 x 103 0.46 x 103 Lần VI (20/12/2019) 9.3 x 105 6.4 x 104 1.4 x 103 0.37 x 103 Lần VII (18/01/2020) 25.2 x 105 35 x 104 2.8 x 103 0.36 x 103 Lần VIII (16/02/2020) 23 x 105 1.6 x 105 14.4 x 103 58 x 102 Lần IX (18/03/2020) 22.7 x 105 3.5 x 105 5.9 x 103 47 x 102 Lần X (18/04/2020) 28 x 105 8.3 x 105 3.8 x 103 23 x 102
Hình 3.9. Số lượng vi khuẩn chỉđiểm (Salmonella)
trong phân gà và chất độn chuồng giữa các lô thí nghiệm
Kết quả bảng 3.14 và hình 3.9 cho thấy, tại thời điểm thả gà số lượng vi khuẩn Salmonella spp ở các lô thí nghiệm ở mức 4 x 104 (lô I); 15.4 x 104 (lô II); 1.4 104 (lô III) và 25.5 x 103 (lô IV). Sau khi bổ sung chế phẩm NanoSan vào khẩu phần ăn, nước uống và phun khử trùng, tiêu độc bằng NanoSan S cho đàn gà thí nghiệm, sau 4 tuần thấy số lượng vi khuẩn Salmonella spp ở lô III và lô VI giảm rõ rệt so với lô I và lô II: (1.4 x 104và 1.61 x 103) So với (3.5 x 105 và 6.7 x 104). Ở lô I số lượng vi khuẩn Salmonella spp tăng theo thời gian nuôi gà từ 4 x 104 đến 28 x 105; lô II (lô chủ động bổ sung thuốc kháng sinh vào khẩu phần ăn để phòng bệnh) số lượng vi khuẩn trong phân chất độn chuồng cũng tăng theo thời gian nuôi từ 15.4 x 104 đến 8.3 x 105. Tuy nhiên, ở các lô sử dụng chế phẩm NanoSan số lượng vi khuẩn
Salmonella spp trong phân và chất độn chuồng lại giảm dần theo thời gian, cụ thể ở lô III (sử dụng NanoSan Probio trộn thức ăn và NanoSan S để phun
KTTĐ) số lượng vi khuẩn giảm từ 1.4 104 xuống 3.8 x 103; lô IV (Sử dụng trộn NanoSan Probio và thức ăn, NanoSan F vào nước uống và phun KTTĐ bằng NanoSan S) số lượng vi khuẩn giảm từ 25.5 x 103xuống còn 23 x 102
khi kết thúc thí nghiệm.
Qua theo dõi số lượng vi khuẩn chỉ điểm Salmonella spp cho thấy khi bổ sung chế phẩm NanoSan vào khẩu phần ăn và phun KTTĐ bằng NanoSan S có tác dụng rõ rệt theo thời gian sử dụng. Khi bổ sung bộ chế phẩm NanoSan vào khẩu phần ăn cho gà đã góp phần cân bằng hệ vi sinh đường tiêu hóa của gà, có tác dụng kìm hãm sự phát triển của vi khuẩn có hại trong đường ruột và môi trường, từ đó hạn chế tỷ lệ gà mắc các bệnh về đường tiêu hóa do chúng gây ra.
3.7. Thử nghiệm một số phác đồđiều trị
Để điều trị bệnh đạt hiệu quả thì yêu cầu quan trọng là xác định loại kháng sinh, hóa dược có tác dụng mạnh trong ức chế hay tiêu diệt các vi khuẩn gây bệnh. Trong đề tài này, chúng tôi áp dụng phương pháp kháng sinh đồ trên thạch của Kirby-Bauer và căn cứ vào đường kính vô khuẩn tại vị trí đặt khoanh giấy tẩm kháng sinh để đánh giá.
3.7.1. Kết quả theo dõi tính mẫn cảm của các chủng vi khuẩn chỉ điểm (Salmonella) phân lập được từ các lô thí nghiệm (Salmonella) phân lập được từ các lô thí nghiệm
Để điều trị bệnh đạt hiệu quả thì yêu cầu quan trọng cần phải xác định tính mẫn cảm của vi khuẩn Salmonella phân lập được với một số kháng sinh và hóa dược đang được dùng phổ biến để phòng và điều trị bệnh cho vật nuôi tại những cơ sở chăn nuôi gia súc, gia cầm.
Vì vậy, chúng tôi đã tiến hành thử kháng sinh đồ trên 20 chủng vi khuẩn
Salmonella phân lập được ở 02 lô thí nghiệm (Lô II và Lô III) với 9 loại kháng sinh, tiến hành kiểm tra và đánh giá theo phương pháp của Kirby- Bauer (1996). Các mẫu giấy kháng sinh do hãng OXOID sản xuất. Kết quả được trình bày ở bảng 3.15.
Bảng 3.15. Tính mẫn cảm của các chủng vi khuẩn chỉđiểm
(Salmonella) phân lập được từ các lô thí nghiệm
Tên kháng sinh
Tính mẫn cảm với kháng sinh của một số chủng
Salmonella spp phân lập được từ các lô thí nghiệm