Baculovirus tái tổ hợp thu được sau khi lây nhiễm cĩ thể được sử dụng để biểu hiện protein M1. Dịch tế bào thu được ở trên được tiến hành làm đơng băng và tan băng liên tiếp 2 lần để giải phĩng virus khỏi tế bào. Ly tâm thu dịch chứa virus (p1) và bảo quản ở -70oC. Để biểu hiện protein 1 trong tế bào cơn trùng, chúng tơi lây nhiễm lại virus p1 với nồng độ 1 pfu/tế bào ( khuyến cáo của nhà sản suất Invitrogen cho lần đầu biểu hiện là từ 0.5 – 10 pfu/tế bào) vào 6 x 105 tế bào Sf9, tiếp tục nuơi cho đến khi tạo CPE.
Để khảo sát sự biểu hiện của protein M1 chúng tơi thu mẫu tế bào Sf9 sau khi nhiễm virus p1 tại các thời điểm 24, 48, 72 và 96 giờ. Protein thu được tại các thời điểm trên được điện di đồng thời trên gel polyacrylamide sau đĩ được nhuộm với Comassie Brilliant Blue để kiểm tra sự cĩ mặt của các protein. Kết quả điện di (hình 3.11) cho thấy, ở thời điểm 48 giờ gần như chưa thấy xuất hiện băng protein với kích thước ~28 kDa của protein M1 tái tổ hợp. Ở 72 giờ băng protein này bắt đầu xuất hiện và đậm hơn ở thời điểm 96 giờ sau lây nhiễm.
Hình 3.11. Kiểm tra sự biểu hiện của protein M1 trong tế bào cơn trùng bằng SDS-PAGE.
DC1: marker protein (fermentas); DC2: mẫu đối chứng âm (khơng lây nhiễm virus); DC3: mẫu protein thu được sau 24 giờ lây nhiễm; DC4: mẫu protein thu được sau 48 giờ lây nhiễm; DC5: mẫu protein thu được sau 72 giờ lây nhiễm; DC6: mẫu protein thu được sau 96 giờ lây nhiễm.
Để khẳng định chắc chắn protein biểu hiện được là protein kháng nguyên M1 của virus cúm H5N1 chúng tơi tiến hành làm phản ứng Western blot với kháng thể sử dụng là kháng thể kháng protein M1 được cung cấp bởi viện thú y và kiểm dịch Hàn Quốc. Kết quả Western blot cho thấy băng protein tái tổ hợp thu nhận được ở 72 giờ và 96 giờ sau khi lây nhiễm virus p1 phản ứng đặc hiệu với kháng thể kháng protein M1 (hình 3.12).
kDa 28 kDa 1 2 3 4 5 6 116.2 66.2 45.0 35.0 25.0 18.4 14.4
Hình 3.12. Kiểm tra phản ứng miễn dịch của protein tái tổ hợp M1 bằng western blot.
DC1: marker màu protein (fermentas); DC2: mẫu protein đối chứng âm (khơng lây nhiễm virus p1); DC3: mẫu protein thu được sau 24h lây nhiễm; DC4: mẫu protein thu được sau 48h lây nhiễm; DC5: mẫu protein thu được sau 72h lây nhiễm; DC6: mẫu protein thu được sau 96h lây nhiễm.
Từ kết quả biểu hiện thử nghiệm protein M1 tái tổ hợp và kết quả western blot chúng tơi cĩ thể khẳng định chắc chắn rằng protein tái tổ hợp được biểu hiện từ chủng baculovirus tái tổ hợp là protein M1 của virus cúm A/H5N1 hay nĩi cách khác chúng tơi đã thiết kế thành cơng baculovirus tái tổ hợp mang gen m1 của virus cúm A/H5N1. Virus tái tổ hợp này sẽ được sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo nhằm mục đích tạo được vaccine VLP của virus cúm A/H5N1. 1 2 3 4 5 6 kDa 70 55 40 35 25 15 28 kDa
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
KẾT LUẬN
Từ các kết quả thu được trong cơng trình nghiên cứu này, chúng tơi đưa các kết luận sau:
Thiết kế thành cơng hộp gen m1 của virus cúm A/H5N1 mang các
thành phần thiết yếu cho việc biểu hiện của gen trong tế bào cơn trùng Sf9 như trình tự Kozak, mã khởi đầu, mã kết thúc.
Thiết kế thành cơng vector trung gian baculovirus mang hộp gen m1
của virus cúm A/H5N1.
Tạo được baculovirus tái tổ hợp mang gen m1 của virus cúm A/H5N1. Biểu hiện được protein M1 tái tổ hợp trong tế bào cơn trùng Sf9.
KIẾN NGHỊ
Tiếp tục được thực hiện các nghiên cứu tiếp theo để tạo vaccine VLP virus cúm A/H5N1.
DANH SÁCH CÁC CƠNG TRÌNH CƠNG BỐ LIÊN QUAN
1. Lê Phương Hằng, Nguyễn Thị Phương, Đơng Văn Quyền (2012) Thiết kế vector trung gian Baculovirus mang hộp gen Hemagglutinin (HA) để tạo virus-like particle của virus cúm A/H5N1 sản xuất Vaccine. Tạp
chí cơng nghệ sinh học 10 (1), 59-64.
2. Nguyễn Thị Phương, Đặng Thị Thùy Dương, Đồng Văn Quyền (2012)
Thiết kế Baculovirus tái tổ hợp mang gen mã hĩa protein M1 của virus cúm A/H5N1 để tạo chủng sản xuất vaccine thế hệ mới bằng cơng nghệ virus- like particle. Tạp chí Khoa học và cơng nghệ 50 (3E) 1214- 1220.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Alexander DJ (2007) An overview of the epidemiology of avian influenza. Vaccine 25(30): 5637-44.
2. Arnon R, Ben-Yedidia T (2009) Preclinical efficacy of a virus-like particle-based vaccine against avian influenza H5N1. Future Microbiol 4:503-5.
3. Baigent SJ, McCauley JW (2001) Glycosylation of haemagglutinin and stalk-length of neuraminidase combine to regulate the growth of avian influenza viruses in tissue culture. Virus Res 79(1-2): 177-185. 4. Basler CF (2007) Influenza viruses: basic biology and potential drug
targets. Infect Disord Drug Targets 7(4): 282-93.
5. Bright RA, Carter DM, Daniluk S, Toapanta FR, Atmad A (2007) Influenza virus-like particles elicit broader immuno responses than whole virion inactivated influenza virus or recombinant hemagglutinin. Vaccine 25: 3871-3878.
6. Chackerian B (2007) Virus-like particles: flexible platforms for vaccine development. Expert Rev. Vaccines 6 (3): 381-390.
7. De Wit E, Fouchier RA (2008) Emerging influenza. J Clin Virol
41(1): 1-6.
8. Doherty PC, Turner SJ, Webby RG, Thomas PG (2006) Influenza and the challenge for immunology. Nat Immunol 7(5): 449-55. 9. FAO ( Food and agriculture Organization of the United Nation)
(2011), “ H5N1 HPAI global overviw”, Empres/FAO – GLE.
10. Fedson DS (2005) Preparing for pandemic vaccination: an international policy agenda for vaccine development. J Public Health Policy 26: 4-29.
11. Galarza JM, Latham T, Cupo A (2005) Virus-like particle (VLP) vaccine conferred complete protection against a lethal influenza virus challenge. Viral Immunol 18: 244-251.
12. Gambotto A, Barratt-Boyes SM, de Jong MD, Neumann G,
Kawaoka Y (2008)Human infection with highly pathogenic H5N1 influenza virus. Lancet 371(9622): 1464-1475.
13. Grgacic EV, Anderson DA (2006) Virus-like particles: passport to immune recognition. Methods 40:60-5.
14. Horimoto T, Kawaoka Y (2006) Strategies for developing vaccines against H5N1 influenza A viruses. Trends. Mol. Med. 12:506-514. 15. Invitrogen (2010), “ Bac-to-Bac baculovirus expression system an
efficient site-specific transposition system to generate baculovirus for high- level expression of recombinant protein”, Catalog nos, 10359-016.
16. Joel R. Haynes , Leslie Dokken , James A. Wiley , Andrew G. Cawthon , John Bigger , Allen G. Harmsen , Charles Richardson (2009) Influenza-pseudotyped Gag virus-like particle vaccines provide broad protection against highly pathogenic avian influenza challenge. Vaccines 27: 530-541.
17. Kang SM, Pushko P, Bright RA, Smith G, Compans RW (2009) Influenza virus-like particles as pandemic vaccines. Microbiol Immunol 333:269-89.
18. Keawcharoen J, Amonsin A, Oraveerakul K, Wattanodorn S, Papravasit T, Karnda S, Lekakul K, Pattanarangsan R, Noppornpanth S, Fouchier RA, Osterhaus AD, Payungporn S, Theamboonlers A and Poovorawan Y (2005) Characterization of the hemagglutinin and
neuraminidase genes of recent influenza virus isolates from different avian species in Thailand. Acta Virol 49(4): 277-280.
19. Kong Q, Richter L, Yang YF, Arntzen CJ, Mason HS, Thanavala Y. Oral immunization with hepatitis B surface antigen expressed in transgenic plants. Proc Natl Acad Sci USA. 2001;98:11539–11544. 20. Korteweg C, Gu J (2008) Pathology, molecular biology, and
pathogenesis of avian influenza A (H5N1) infection in humans. Am J
Pathol 172(5): 1155-1170.
21. Kozak M. (1987) An analysis of 5’-noncoding sequences from 699 vertebrate messenger RNAs. Nucleic Acids Res 15:8125–8148.
22. Kratz PA, Bưttcher B, Nassal M (1999) Native display of complete foreign protein domains on the surface of hepatitis B virus capsids.
Proc Natl Acad Sci USA 96: 1915-1920.
23. Li Q, Cao C, Chackerian B, Schiller J, Gordon M, Ugen KE, Morgan D (2004) Overcoming antigen masking of anti-amyloidbeta antibodies reveals breaking of B cell tolerance by virus-like particles in amyloidbeta immunized amyloid precursor protein transgenic mice. BMC Neurosci 5: 21.
24. Maurer P, Jennings GT, Willers J, Rohner F, Lindman Y, Roubicek K, Renner WA, Müller P, Bachmann MF (2005) A therapeutic vaccine for nicotine dependence: preclinical efficacy, and Phase I safety and immunogenicity. Eur j Immunol 35: 2031-2040.
25. Murphy BR, Webster RG (1996). Orthomyxoviruses. Fields
Virology, pp. 1397–445.
26. Nayak D, Hui E, Barman S (2004) Assembly and budding of influenza virus. Virus Res 106(2): 147-165.
27. Neirynck S, Deroo T, Saelens X, Vanlandschoot P, Jou WM, Fiers W. (1999) A universal influenza A vaccine based on the extracellular domain of the M2 protein. Nat. Med. 5 (10): 1157-1163.
28. New N, He Q, Damrongwatanapolin S, Du Q, Manopo I,
Limlamthong Y, Fenner BJ, Spencer L, Kwang J (2006) Expression 29. of hemagglutinin protein from the avian influenza virus H5N1 in a
baculovirus/insect cell system significant enhanced by suspension culture. BMC Microbiol 24: 6-16.
30. Nicholson KG (2009) Influenza and vaccine development: a continued battle. Expert Rev. Vaccines 8: 373-374.
31. Pandey A, Singh N, Sambhara S, Mittal SK (2010) Egg-independent vaccine strategies for highly pathogenic H5N1 influenza viruses.
Hum Vaccin. 24;6(2).
32. Pattenden LK, Middelberg APJ, Niebert M, Lipin DI (2005) Toward the Preparative and Large Scale Precision Manufacture of Virus-Like Particles. Trends Biotechnol 23: 523-529.
33. Peabody DS (2003) A viral platform for chemical modification and multivalent display. J Nanobiotechnology 1: 5
34. Peabody DS (2003) A viral platform for chemical modification and multivalent display. J Nanobiotechnology 1: 5
35. Pushko P, Tumpey TM, Bu F, Knell J, Robinson R, Smith G. (2005) Influenza virus-like particles comprised of the HA, NA, and M1 proteins of H9N2 influenza virus induce protective immune responses in BALB/c mice, Vaccine. 23(50):5751-9.
36. Rabadan R, Levine AJ, Robins H (2006) Comparison of avian and human influenza A viruses reveals a mutational bias on the viral genomes. J Virol 80(23): 11887-11891.
37. Raja KS, Wang Q, Gonzalez MJ, Manchester M, Johnson JE, Finn MG (2003) Hybrid virus-polymer materials 1. Synthesis and
properties of PEG-decorated cowpea mosaic virus.
Biomacromolecules 4: 472-476.
38. Rưhn TA, Jennings GT, Hernandez M, Grest P, Beck M, Zou Y, Kopf M, Bachmann MF (2006) Vaccination against IL-17 suppresses autoimmune arthritis and encephalomyelitis. Eur J Immunol 36(11): 2857-2867.
39. Salzberg SL (2007) Genome Analysis Linking Recent European and African Influenza (H5N1) Viruses. Emerg Infect Dis 13(5): 713-718. 40. Silas L, Johnson N, Rexe K (2007) Safety is not negotiable: the importance of occupational health and safety to pandemic planning.
Healthc Pap 8(1): 8-16.
41. Smith GJ, Naipospos TS, Nguyen TD, de Jong MD, Vijaykrishna D, Usman TB (2006) Evolution and adaptation of H5N1 influenza virus in avian and human hots Indonesia and Vietnam. Virology 350: 68-
258.
42. Song JM, Hossain J, Yoo DG, Lipatov AS, Davis CT, Quan FS, Chen LM, Hogan RJ, Donis RO, Compans RW, Kang SM (2010) Protective immunity against H5N1 influenza virus by a single dose vaccination with virus-like particles. Virology 405:165-75.
43. Suarez DL, Schultz-Cherry S (2000) Immunology of avian influenza virus: a review. Dev Comp Immunol 24(2-3): 269-283.
44. Tacket CO, Mason HS, Losonsky G, Clements JD, Levine MM, Arntzen CJ (1998) Immunogenicity in humans of a recombinant bacterial antigen delivered in a transgenic potato. Nat. Med. 4: 607– 609.
45. Vey M, Orlich M, Adler S, Klenk HD, Rott R and Garten W (1992) Hemagglutinin activation of pathogenic avina influenza viruses of serotype H7 requires the protease recognition motif R-X-K/R-R.
Virology 188: 408-413.
46. Wagner R, Matrosovich M, Klenk H (2002) Functional balance between haemagglutinin and neuraminidase in influenza virus infections. Med Virol 12(3): 159-166.
47. Wang Q, Lin T, Johnson JE, Finn MG (2002) Natural
supramolecular building blocks. Cysteine-added mutants of cowpea mosaic virus. Chem Biol 9: 813-819.
48. Wasilenko JL, Lee CW, Sarmento L, Spackman E, Kapczynski DR,
Suarez DL, Pantin-Jackwood MJ (2008) NP, PB1, and PB2 viral genes contribute to altered replication of H5N1 avian influenza viruses in chickens. J Virol 82(9): 4544-4553.
49. Weber TP, Stilianakis NI (2007) Ecologic immunology of avian influenza (H5N1) in migratory birds. Emerg Infect Dis 13(8): 1139- 1143.
50. Webster RG (1998) Influenza: an emerging disease. Emerg Infect Dis 4: 436-441.
51. Webster RG, Guan Y, Peiris M, Walker D, Krauss S, Zhou NN, Govorkova EA, Ellis TM, Dyrting KC, Sit T, Perez DR, Shortridge Willis, N J (1997), "Edward Jenner and the eradication of smallpox.", Scottish medical journal 42 (4): 118-21
52. Zhao ZM, Shortridge KF, Garcia M, Guan Y, Wan XF (2008) Genotypic diversity of H5N1 highly pathogenic avian influenza viruses. J Gen Virol 89(9): 2182-2193
53. Zhou JJ, Fu J, Fang DY, Yan HJ, Tian J, Zhou JM, Tao JP, Liang Y, Jiang LF (2007) Molecular characterization of the surface glycoprotein genes of an H5N1 influenza virus isolated from a human in Guangdong, China. Arch Virol 152(8): 1515-1521
54. http://www.cucthuy.gov.vn/Pages/news_detail.aspx?NewsId=209. 55. http://www.who.int/topics/vaccines/en/
PHỤ LỤC
Influenza A virus (A/Hatay/2004/(H5N1)) M1 gene for Matrix protein 1, genomic RNA Sequence ID: emb|AM040045.1|Length: 774Number of Matches: 1
Range 1: 8 to 763GenBankGraphics Next Match Previous Match Alignment statistics for match #1
Score Expect Identities Gaps Strand
1391 bits(753) 0.0 755/756(99%) 0/756(0%) Plus/Plus Query 1 ATGGGTCTTCTAACCGAGGTCGAAACGTACGTTCTCTCTATCATCCCGTCAGGCCCCCTC 60 ||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 8 ATGAGTCTTCTAACCGAGGTCGAAACGTACGTTCTCTCTATCATCCCGTCAGGCCCCCTC 67 Query 61 AAAGCCGAGATCGCGCAGAAACTTGAAGATGTCTTTGCAGGAAAGAACACCGATCTCGAG 120 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 68 AAAGCCGAGATCGCGCAGAAACTTGAAGATGTCTTTGCAGGAAAGAACACCGATCTCGAG 127 Query 121 GCTCTCATGGAATGGCTAAAGACAAGACCAATCCTGTCACCTCTGACTAAAGGGATTTTG 180 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 128 GCTCTCATGGAATGGCTAAAGACAAGACCAATCCTGTCACCTCTGACTAAAGGGATTTTG 187 Query 181 GGATTTGTATTCACGCTCACCGTGCCCAGTGAGCGAGGACTGCAGCGTAGACGCTTTGTC 240 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 188 GGATTTGTATTCACGCTCACCGTGCCCAGTGAGCGAGGACTGCAGCGTAGACGCTTTGTC 247 Query 241 CAGAACGCCCTAAATGGAAATGGAGATCCAAATAATATGGATAGGGCAGTTAAGCTATAT 300 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 248 CAGAACGCCCTAAATGGAAATGGAGATCCAAATAATATGGATAGGGCAGTTAAGCTATAT 307 Query 301 AAGAAGCTGAAAAGAGAAATAACATTCCATGGGGCTAAGGAGGTCGCACTCAGCTACTCA 360 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 308 AAGAAGCTGAAAAGAGAAATAACATTCCATGGGGCTAAGGAGGTCGCACTCAGCTACTCA 367 Query 361 ACCGGTGCACTTGCCAGTTGCATGGGTCTCATATACAACAGGATGGGAACGGTGACTACG 420 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 368 ACCGGTGCACTTGCCAGTTGCATGGGTCTCATATACAACAGGATGGGAACGGTGACTACG 427 Query 421 GAAGTGGCTTTTGGCCTAGTGTGTGCCACTTGTGAGCAGATTGCAGATTCACAGCATCGG 480 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 428 GAAGTGGCTTTTGGCCTAGTGTGTGCCACTTGTGAGCAGATTGCAGATTCACAGCATCGG 487
Query 481 TCTCACAGACAGATGGCAACTATCACCAACCCACTAATCAGACATGAGAACAGAATGGTG 540 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 488 TCTCACAGACAGATGGCAACTATCACCAACCCACTAATCAGACATGAGAACAGAATGGTG 547 Query 541 CTGGCCAGCACTACAGCTAAGGCCATGGAGCAGATGGCGGGATCAAGTGAGCAGGCAGCG 600 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 548 CTGGCCAGCACTACAGCTAAGGCCATGGAGCAGATGGCGGGATCAAGTGAGCAGGCAGCG 607 Query 601 GAAGCCATGGAGATTGCTAATCAGGCTAGGCAGATGGTGCAGGCAATGAGGACAATTGGG 660 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 608 GAAGCCATGGAGATTGCTAATCAGGCTAGGCAGATGGTGCAGGCAATGAGGACAATTGGG 667 Query 661 ACTCATCCTAACTCTAGTGCTGGTCTGAGAGATAATCTTCTTGAAAATTTGCAGGCCTAC 720 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 668 ACTCATCCTAACTCTAGTGCTGGTCTGAGAGATAATCTTCTTGAAAATTTGCAGGCCTAC 727 Query 721 CAGAAACGAATGGGAGTGCAGATGCAGCGATTCAAG 756 |||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 728 CAGAAACGAATGGGAGTGCAGATGCAGCGATTCAAG 763
LỜI CAM ĐOAN
Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của tơi và một số kết quả cùng cộng tác với các đồng sự khác. Các số liệu và kết quả trình bày trong luận văn là trung thực.
Hà Nội, ngày tháng năm 2013
Tác giả