Để tạo ra được hạt giả virus cúm A/H5N1 địi hỏi rất nhiều bước, từ nhân dịng các gen, kiến tạo hộp gen mang các yếu tố cần thiết để biểu hiện gen trong tế bào cơn trùng, thiết kế các vector baculovirus trung gian mang hộp gen và cuối cùng là đồng chuyển nạp vector này với DNA của baculovirus vào tế bào cơn trùng để tạo baculovirus tái tổ hơp biểu hiện và đĩng gĩi các protein đích thành VLP. Sự thành cơng của quá trình đồng chuyển nạp phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố như: tình trạng tế bào, độ tinh sạch của DNA cần chuyển vào tế bào, tỷ lệ giữa vector tái tổ hợp mang gen đích với DNA của baculovirus, lượng chất chuyển nạp, mơi trường nuơi cấy.
Theo như hướng dẫn của nhà sản xuất Invitrogen [15], tế bào cơn trùng Sf9 phát triển đến pha tăng trưởng (1,5 - 2,5x106 tế bào/ml) trong mơi trường Sf900-II bổ sung 10% FBS, với số thế hệ thấp (5-20 thế hệ hay số lần cấy
chuyển). Một ngày trước khi đồng chuyển nạp (co-transfection), cấy chuyển tế bào sang các đĩa nuơi cấy (60mm) mới, tính lượng tế bào sao cho ngày hơm sau mật độ tế bào trên đĩa 60 mm đạt khoảng 80-90%. Sau đĩ, phức hợp vector baculovirus tái tổ hợp và DNA của baculovirus được đồng chuyển nạp vào tế bào trong điều kiện nuơi cấy lớp đơn nuơi trong mơi trường Sf900 II khơng bổ sung huyết thanh và kháng sinh. Bởi vì, mơi trường cĩ huyết thanh sẽ làm giảm hiệu quả chuyển nhiễm. Tế bào Sf9 sau khi thực hiện đồng chuyển nạp được nuơi cấy và quan sát dưới kính hiển vi soi ngược ở độ phĩng đại 10X, 20X và 40X tại thời điểm 24, 48, 72 và 96 giờ.
Trong tế bào, nhờ quá trình tài tổ hợp trình tự tương đồng, hộp gen m1 trong baculovirus vector sẽ chuyển sang DNA khung của baculovirus tạo nên các virus tái tổ hợp mang gen đích. Dựa vào kết quả cơng trình nghiên cứu của Nwe và cộng sự năm 2006, và hướng dẫn của nhà sản xuất Invitrogen thì đến thời điểm từ 6- 24 giờ sau khi bị lây nhiễm, tế bào Sf9 cĩ dấu hiệu bị baculovirus xâm nhiễm thể hiện bởi sự xuất hiện của các CPE (Cytopathic effect) tạm dịch là các tác động gây bệnh tế bào như: tế bào ngừng phân chia, đường kính tế bào tăng, nhân tế bào lớn hơn, tế bào tăng sản xuất bộ gen của virus và tạo ra virus ngoại bào (extracellular virus). Đến thời điểm 20- 36 giờ, tế bào ngừng sản xuất virus ngoại bào, bắt đầu cĩ xuất hiện sản phẩm gen tái tổ hợp nằm dưới lớp promotor polyhedrin, mật độ tế bào giảm do tế bào chết và bị ly giải. Thời điểm thích hợp để thu nhận baculovirus sẽ là 72 giờ sau lây nhiễm.
Sau khi lây nhiễm baculovirus, kết quả thí nghiệm chúng tơi quan sát được tại thời điểm 24 giờ là: đĩa lây nhiễm baculovirus đã cĩ một số tế bào Sf9 cĩ dấu hiệu ngừng phân chia, soi dưới kính hiển vi soi ngược ở độ phĩng đại 40X và so sánh với mẫu chứng âm khơng cho lây nhiễm baculovirus cho thấy sự khác biệt rất rõ ràng khi các tế bào chứng âm đã phát triển phủ kín bề
mặt đĩa nuơi cấy cịn ở đĩa cĩ lây nhiễm baculovirus một số tế bào cĩ nhân tế bào lớn hơn so với bình thường ( mẫu chứng âm hình 3.9A). Tới thời điểm 48 giờ và 72 giờ baculovirus tiếp tục lây nhiễm vào các tế bào Sf9 trong mơi trường nuơi cấy. Tuy nhiên, hình ảnh quan sát tại thời điểm 72 giờ sau lây nhiễm cho thấy dấu hiệu vẫn chỉ xuất hiện ở một số nhĩm tế bào mà chưa phải toàn bộ số tế bào trên bề mặt đĩa nuơi cấy (hình 3.9B).
Hình 3.9. Đồng chuyển nạp vector baculovirus tái tổ hợp mang hộp gen m1
và DNA của baculolvirus vào tế bào cơn trùng tạo virus tái tổ hợp. (A) Hình ảnh tế bào Sf9 trước khi chuyển nạp, (B) baculovirus tái tổ hợp mang gen m1 sau 72 giờ lây nhiễm, (C) baculovirus tái tổ hợp mang gen m1
sau 96 giờ lây nhiễm.
A B
Tại thời điểm 96 giờ sau lây nhiễm, kết quả quan sát cho thấy baculovirus đã xâm nhiễm vào tồn bộ tế bào Sf9 cĩ trong đĩa nuơi cấy thể hiện ở việc xuất hiện hạt nhỏ trên hầu hết bề mặt các tế bào, lượng tế bào chết và ly giải nhiều cùng với hiện tượng một số tế bào tách khỏi bề mặt đĩa nuơi cấy dẫn đến mật độ tế bào giảm mạnh (hình 3.9C), đây là thời điểm thu nhận baculovirus tái tổ theo khuyến cáo của nhà sản xuất Invitrogen khi mà lượng tế bào chết khoảng 70 – 80% [15]. Và như vậy cĩ thể kết luận rằng quá trình tạo baculovirus tái tổ hợp mang gen m1 đã thành cơng. Thu tồn bộ dịch nuơi cấy và tế bào vào ống falcon 50 ml vơ trùng, bảo quản dịch - 70oC cho đến khi thực hiện các thí nghiệm tiếp theo.
Trong thí nghiệm của chúng tơi, thời gian xâm nhiễm và biểu hiện của baculovirus chậm hơn so với các cơng trình nghiêm cứu trước của Nwe N năm 2006 và Pushko P. năm 2005 [28], [34]. Hai tác giả này cho biết baculovirus tái tổ hợp được thu nhận ở thời điểm 72 giờ sau lây nhiễm bacuvirus vào tế bào cơn trùng đơn lớp đúng như hướng dẫn của nhà sản xuất Invitrogen [15]. Theo như tìm hiểu của chúng tơi, thời gian biểu hiện của baculovirus tái tổ hợp trong tế bào Sf9 cĩ thể bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố như : sự phát triển của tế bào, lượng vector trung gia tái tổ hợp chuyển nhiễm và lượng Cellfectin II (Invitrogen). Mặt khác để baculovirus biểu hiện được cần phải dựa trên bộ máy di truyền của tế bào chủ Sf9, và tế bào chủ phát triển mạnh là một trong những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sự biểu hiện của baculovirus. Trong thí nhiệm của chúng tơi, ngồi các yếu tố kể trên kết quả cịn cĩ thể bị ảnh hưởng bởi sự ước lượng nồng độ DNA bộ khung baculovirus và vector trung gian mang hộp gen m1 đưa vào chuyển nạp chưa được tối ưu (cĩ thể cao hơn hoặc thấp hơn so với giá trị thực) nên kết quả thu được chưa tối ưu. Vì vậy, để đạt được hiệu quả nuơi cấy baculovirus tái tổ hợp cao thì tế bào cần được chuẩn hĩa về điều kiện nuơi cấy cũng như các
yếu tố hỗ trợ quá trình chuyển nhiễm và lượng bacmid đồng chuyển nạp cũng cần tính tốn để đạt được hiệu quả cao. Với các thí nghiệm sau, chúng tơi sẽ phải tối ưu hĩa quá trình chuyển nhiễm baculovirus tái tổ hợp vào tế bào Sf9 để cĩ thể thu được hiệu quả chuyển nhiễm tốt nhất, đồng thời tiết kiệm được thời gian cũng như kinh tế phục vụ cho các đề tài nghiên cứu ứng dụng tiếp theo.