Quá trình tách chiết được thực hiện theo các bước sau: (1) Cấy các khuẩn lạc trắng và một khuẩn lạc xanh vào 2 ml mơi trường LBA. Nuơi lắc qua đêm ở 370C, 200 v/p; (2) Ly tâm hỗn dịch tế bào đã biến nạp 12000 v/p trong 1 phút, thu cặn; (3) Bổ sung lần lượt các dung dịch Sol I (Tris-HCl 50 mM, pH 8,0 + EDTA 10 mM, pH 8,0); Sol II (200 mM NaOH + SDS 1%); Sol III (Kac-Potasium Acetat 3M, pH 5,5); (4) Chiết bằng chloroform: izoamylalcohol 24:1; (5) Thu dịch nổi, tủa bằng muối NaOAC 3M và Ethanol 100% ở -200C ít nhất 1 giờ; (6) Ly tâm, thu cặn, rửa cặn bằng Ethanol 70%, làm khơ cặn và hịa tan lại trong dung dịch TE-RNase (100 g/ml), ủ trong bể ổn nhiệt 370C trong 1 giờ để loại RNA. (7) Điện di kiểm tra trên gel agarose
1% với mẫu đối chứng là DNA plasmid được tách từ khuẩn lạc xanh và bảo quản ở -200C.
2.2.7. Phương pháp cắt DNA bằng enzyme giới hạn
Enzyme giới hạn là Nuclease nội bào (Endonuclease) cĩ khả năng nhận biết các đoạn DNA với các trình tự nucleotit nhất định, bám vào đoạn DNA đĩ và cắt cả hai sợi của phân tử DNA.
Phản ứng cắt vector tách dịng tái tổ hợp với enzyme hạn chế gồm các thành phần: 7,7 l H2O khử ion vơ trùng + 1 l dung dịch đệm của EcoR I + 1 l DNA plasmid + 0,3l enzyme giới hạn EcoR I. Hỗn hợp phản ứng được trộn đều, ủ ở nhiệt độ 370C trong 2 giờ. Sản phẩm phản ứng được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1%.
Phản ứng cắt vector biểu hiện tái tổ hợp với enzyme hạn chế gồm các thành phần: 7,3 l H2O khử ion vơ trùng + 1 l dung dịch đệm số 2 + 0,1 l BSA + 1 l DNA plasmid + 0,3 l enzym giới hạn BamH I + 0,3 l enzyme giới hạn XhoI. Hỗn hợp phản ứng được trộn đều, ủ ở nhiệt độ 370C trong 4 giờ. Sản phẩm phản ứng được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1% .
2.2.8. Tinh sạch plasmid
Để tinh sạch vector tái tổ hợp phục vụ cho mục đích đọc trình tự, chúng tơi sử dụng bộ sinh phẩm S.N.A.P Miniprep Kit của hãng Invitrogen. Quá trình này gồm 2 bước cơ bản:
- Gắn plasmid lên cột.
- Đẩy DNA plasmid ra khỏi cột.
2.2.9. Xác định trình tự gen bằng máy giải trình tự gen tự động
Trình tự DNA được xác định theo phương pháp của Sanger & đồng tác giả, trên máy xác định trình tự DNA tự động ABI prism 3100 Sequencer (Applied Biosystems) với bộ kit xác định trình tự BigDye® Terminater v3.1
Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems). Quy trình xác định trình tự được tiến hành theo 3 bước:
- Bước 1: Thực hiện phản ứng tổng hợp với thành phần như bảng 2.1.
Bảng 2.1: Thành phần phản ứng để xác định trình tự Thành phần Thể tích (µl) H2O khử ion vơ trùng 5,725 Bigdye 3 DNA (200 ng) 2 Mồi (3,2 pmol/µl) 1,275 Đệm 2,5X 3 Tổng thể tích 15
Chu trình nhiệt được thực hiện như sau: 960C 1 phút, 960C 10 giây, 500C 5 giây, 600C 4 phút, 25 chu kỳ (từ bước 2 đến bước 4), 600C 4 phút, kết thúc ở 40C.
- Bước 2: Tinh sạch sản phẩm sau khi tổng hợp + Bổ sung 5 l EDTA 12,5 mM, pH=8.
+ Bổ sung 60 l Ethanol 100%. Ủ ở nhiệt độ phịng trong 15 phút + Ly tâm 12000 v/p trong 20 phút để thu cặn
+ Rửa cặn bằng 60 l Ethanol 70%. Ly tâm 12000 v/p trong 10 phút để thu cặn
+ Làm khơ cặn trong 3 phút bằng máy Speed vac + Hịa cặn trong 10 l Hidiformamide
+ Biến tính ở 950C trong 3 phút