Đoạn gen m1 sau khi khuếch đại cĩ thể xử lý trực tiếp bằng enzyme
giới hạn rồi đưa vào vector trung gian pBluBac4.5/V5-His-TOPO, tuy nhiên các enzyme giới hạn thường rất khĩ nhận biết và cắt ở những vị trí đầu cùng của phân tử DNA, vì vậy chúng tơi đã tiến hành tạo vector tái tổ hợp dịng
1 2 2
trung gian bằng cách gắn sản phẩm PCR vào vector tách dịng pCR® 2.1 và biến nạp vào tế bào khả biến E. coli chủng DH5α. Thể biến nạp được cấy trên mơi trường LB đặc cĩ bổ sung Ampicilin (100 µg/ml), IPTG (1mM) và X-gal (100 µg/ml). Chúng tơi chọn ngẫu nhiên 4 khuẩn lạc trắng và một khuẩn lạc xanh để tách plasmid. Kết quả kiểm tra các plasmid tái tổ hợp trên gel agarose 1% cho thấy cĩ 3 plasmid ở đường chạy số 1, 3 và 4 tách chiết từ các khuẩn lạc trắng cĩ kích thước cao hơn vector pCR® 2.1 (hình 3.2A). Như vậy cĩ khả năng các plasmid này cĩ mang đoạn gen mã hố cho protein M1.
Hình 3.2: Chọn lọc các dịng plasmid pCR2.1 tái tổ hợp mang hộp gen m1
bằng điện di trên gel agarose 1%.
A: DC1-4: DNA plasmid tách từ khuẩn lạc trắng; DC5: khuẩn lạc xanh. B: DC6: Sản phẩm PCR gen m1 dùng làm đối chứng; DC7-9: DNA plasmid tái tổ hợp được xử lý bằng enzyme giới hạn BamH I và Hind III, DC10: thang DNA chuẩn 1kb.
Để xác định các dịng plasmid số 1, 3 và 4 cĩ mang gen mã hĩa protein M1 hay khơng, chúng tơi tiến hành cắt kiểm tra các plasmid trên bằng enzyme giới hạn. Do mồi thiết kế dùng để khuếch đại gen mã hĩa protein M1 đã cĩ vị
B 1 2 3 4 5 A B 6 7 8 9 10 775bp 3000bp 750bp
trí nhận biết của hai enzyme giới hạn BamH I và Hind III ở hai đầu, nên khi các dịng DNA plasmid cĩ gắn sản phẩm PCR sau khi xử lý bằng 2 enzyme giới hạn trên sẽ văng ra một đoạn DNA cĩ chiều dài tương đương với kích thước của sản phẩm PCR gắn vào và một đoạn cĩ kích thước bằng kích thước của vector pCR®2.1 gốc. Kết quả phân tích sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp trên gel agarose 1% cho thấy: plasmid số 3 và 4 văng ra một đoạn DNA cĩ kích thước tương đương kích thước của sản phẩm PCR gen m1 (hình 3.2B).
Như vậy, chúng tơi đã chọn được hai dịng plasmid tái tổ hợp số 3, 4 mang gen m1.
Để khẳng định kết chắc chắn gen tạo dịng chính là gen mã hố protein M1 của virus cúm H5N1, chúng tơi tiến hành tinh sạch các dịng plasmid tái tổ hợp số 3, 4 bằng S.N.A.P Miniprep Kit (Invitrogen) và giải trình tự nucleotide bằng máy xác định trình tự DNA tự động (ABI 3100). Chúng tơi sử dụng dịng plasmid tái tổ hợp số 3 để phân tích tiếp bằng giải trình DNA. Kết quả phân tích trình tự gen bằng phần mềm PC-Gene được thể hiện trên hình 3.3.
ID M1pPCR PRELIMINARY; DNA;
SQ SEQUENCE 775 BP; 225a 166t 209g 175c
ggatccggtc atgggtcttc taaccgaggt cgaaacgtac gttctctcta tcatcccgtc aggccccctc aaagccgaga tcgcgcagaa acttgaagat gtctttgcag gaaagaacac cgatctcgag gctctcatgg aatggctaaa gacaagacca atcctgtcac ctctgactaa agggattttg ggatttgtat tcacgctcac cgtgcccagt gagcgaggac tgcagcgtag acgctttgtc cagaacgccc taaatggaaa tggagatcca aataatatgg atagggcagt taagctatat aagaagctga aaagagaaat aacattccat ggggctaagg aggtcgcact cagctactca accggtgcac ttgccagttg catgggtctc atatacaaca ggatgggaac ggtgactacg gaagtggctt ttggcctagt gtgtgccact tgtgagcaga ttgcagattc acagcatcgg tctcacagac
agatggcaac tatcaccaac ccactaatca gacatgagaa cagaatggtg ctggccagca ctacagctaa ggccatggag cagatggcgg gatcaagtga gcaggcagcg gaagccatgg agattgctaa tcaggctagg cagatggtgc aggcaatgag gacaattggg actcatccta actctagtgc tggtctgaga gataatcttc ttgaaaattt gcaggcctac cagaaacgaa tgggagtgca gatgcagcga ttcaagtgaaagctt
Hình 3.3. Trình tự gen m1 tách dịng trong vector pCR2.1
Trình tự nucleotide gạch chân, in nghiêng là trình tự cắt của hai enzyme giới hạn BamH I, Hind III và trình tự Kozak. Trình tự gen mã hĩa cho protein M1 bắt đầu từ mã khởi đầu ATG (in đậm) đến mã kết thúc TGA (in đậm) gồm 756 nucleotide.
Từ kết quả phân tích bằng phần mềm tìm kiếm BLAST và Fasta3 chúng tơi cĩ thể khẳng định chắc chắn đoạn gen được tách dịng chính là gen
m1 của virus cúm A/H5N1 với kích thước 775 nucleotide gồm đầy đủ các
trình tự (trình trình tự Kozak, mã khởi đầu ATG và mã kết thúc TGA) cần thiết cho quá trình biểu hiện protein M1 trong tế bào cơn trùng. So sánh với trình tự gen m1 của virus cúm A/H5N1 cơng bố trong ngân hàng dữ liệu gen quốc tế cho thấy, đoạn gen mã hĩa kháng nguyên M1 của virus cúm phân lập ở Việt Nam cĩ độ tương đồng cao so với các chủng lưu hành trên thế giới, đạt từ 99,5 đến 100% (phụ lục). Dịch mã trình tự nucleotide gen m1 sang trình tự amino acid, chúng tơi thu được một protein cĩ trình tự gồm 252 amino acid với khối lượng phân tử khoảng 28 kDa. Đoạn gen được dịch mã thơng suốt, khơng xuất hiện mã kết thúc (stop codon) trong gen (hình 3.4).
1 M S L L T E V E T Y V L S I I P S G P L K A E I A Q K L E D 31 V F A G K N T D L E A L M E W L K T R P I L S P L T K G I L 61 G F V F T L T V P S E R G L Q R R R F V Q N A L N G N G D P 91 N N M D R A V K L Y K K L K R E I T F H G A K E V A L S Y S 121 T G A L A S C M G L I Y N R M G T V T T E V A F G L V C A T 151 C E Q I A D S Q H R S H R Q M A T I T N P L I R H E N R M V 181 L A S T T A K A M E Q M A G S S E Q A A E A M E V A N Q A R 211 Q M V Q A M R T I G T H P N S S A G L R D N L L E N L Q A Y 241 Q K R M G V Q M Q R F K*
Hình 3.4. Trình tự amino acid suy diễn của protein M1