Để tạo baculovirus tái tổ hợp biểu hiện protein M1, gen m1 cần được
thiết kế vào vector trung gian baculovirus. Vector trung gian mang gen m1
(pBluBacM1) này sau đĩ sẽ được đồng chuyển nạp (co-tranfection) với bộ khung DNA của baculovirus vào tế bào cơn trùng Sf9 để tạo baculovirus tái tổ hợp nhờ cơ chế trao đối chéo trình tự tương đồng (homologous recombination). Các bước tạo vector pBluBacM1 được mơ tả ở hình 3.5.
Hình 3.5. Sơ đồ minh họa quá trình thiết kế vector trung gian baculovirus
Vector pCR2.1 mang hộp gen m1 và vector trung gian pBluBac4.5/V5-
His-TOPO trong bộ kit của hãng Invitrogen được xử lý đồng thời bằng 2 enzym giới hạn BamHI và HindIII, sau đĩ được tinh chế và thu lại bằng bộ kit S.N.A.P free UV của hãng Invitrogen. Kết quả kiểm tra sản phẩm thơi gel cho thấy trên đường chạy số 2 và 3 xuất hiện băng DNA đơn nhất, sắc nét, cĩ kích thước tương ứng với kích thước hộp gen m1 (775 bp) và vector
pBluBac4.5/V5-His-TOPO (5000 bp) (Hình 3.6A). Như vậy, chúng tơi đã tạo được các đầu dính trên gen m1 và trên vector trung gian pBluBac4.5/V5-His- TOPO bằng hai enzyme giới hạn BamHI và HindIII. Phản ứng gắn gen m1 và vector pBluBac4.5/V5-His-TOPO mang hai đầu dính tương ứng bằng enzyme T4 DNA ligase được thực hiện như trình bày ở phần phương pháp nghiên cứu. Dưới tác dụng của enzyme nối T4 DNA ligase, vector pBluBac4.5/V5- His-TOPO và gen m1 với các đầu dính sẽ dễ dàng gắn với nhau để tạo vector tái tổ hợp pBluBacM1. Như vậy hộp gen m1 được gắn vào vùng xen giữa gen lacZ và ORF 1629 là hai vị trí sẽ xảy ra sự trao đổi chéo trình tự tương đồng giữa pBluBac4.5/V5-His-TOPO và bộ DNA của baculovirus để tạo ra bộ khung của baculovirus tái tổ hợp.
Để chọn lọc vector trung gian pBluBac4.5/V5-His-TOPO mang hộp gen m1, vector tái tổ hợp được biến nạp vào tế bào khả biến E. coli chủng
DH5α. Các thể biến nạp sau đĩ được cấy trải trên mơi trường LB đặc cĩ bổ sung Ampicilin (100 µg/ml). Trên mơi trường này chỉ cĩ những dịng mang vector tái tổ hợp mới sinh trưởng được và phát triển thành những khuẩn lạc. Chúng tơi chọn ngẫu nhiên 5 khuẩn lạc từ đĩa nuơi cấy để tách plasmid và kiểm tra sự cĩ mặt của hộp gen m1 bằng điện di trên gel agarose và xử lý với 2 enzyme giới hạn BamHI và Hind III. Kết quả điện di trên gel agarose 1%
cĩ kích thước lớn hơn plasmid pBluBac4.5/V5-His-TOPO gốc khơng mang gen ngoại lai, như vậy 4 plasmid này cĩ khả năng đã mang hộp gen m1.
Hình 3.6: Kết quả thiết kế vector baculovirus trung gian mang hộp gen m1.
A: Kiểm tra sản phẩm thơi gel của hộp gen m1 và vector pBluBac4.5/V5-His- TOPO sau khi xử lý bằng enzyme BamHI và HindIII. DC1: thang DNA chuẩn (1kb fermentas); DC2: hộp gen m1 sau khi thơi gel; DC3: vector trung gian
pBluBac4.5/V5-His-TOPO.
B: Kiểm tra plasmid tái tổ hợp tách từ E. coli đã được biến nạp sản phẩm lai giữa vector trung gian pBluBac4.5/V5-His-TOPO và hộp gen m1; DC1:
plasmid pBluBac4.5/V5-His-TOPO gốc khơng mang gen; DC2-6: các plasmid tái tổ hợp thu nhận từ đĩa biến nạp sản phẩm lai.
Để khẳng định 4 dịng plasmid tái tổ hợp mang hộp gen m1, 4 dịng
plasmid này được cắt bằng BamHI và HindIII và chạy điện di phân tích sản phẩm cắt trên gel agarose 1%. Kết quả điện di sản phẩm cắt nhận thấy cĩ hai đoạn DNA với kích thước khoảng 5000 bp và ~775 bp tương ứng với kích thước của plasmid pBluBac4.5/V5-His-TOPO gốc và hộp gen m1 (Hình
3.7A). Như vậy cĩ thể khẳng định chúng tơi đã thiết kế thành cơng vector
A B
775bp 750bp
5000bp
baculovirus mang hộp gen m1 của virus cúm A/H5N1. Các plasmid
pBluBac4.5/V5-His-TOPO tái tổ hợp mang hộp gen m1 kí hiệu là
pBluBacM1.
1 2 3 4 5 1 2 3 4 5
Hình 3.7. Kiểm tra khả năng mang gen m1 của các plasmid pBluBac4.5/V5-
His-TOPO tái tổ hợp
A. Các plasmid tái tổ hợp được xử lý với enzyme BamHI và HindIII.
DC1: thang DNA chuẩn 1kb; DC 2-5: plasmid tái tổ hợp 1, 2, 3 và 5 được xử lý cắt với BamHI và HindIII .
B. Sản phẩm PCR khuếch đại gen m1 từ các plasmid pBluBac4.5/V5-His-
TOPO tái tổ hợp.
DC1: thang DNA chuẩn 1kb; DC 2-5: sản phẩm PCR khuếch đại gen m1 từ
plasmid pBluBac4.5/V5-His-TOPO tái tổ hợp sử dụng cặp mồi PFSP-F và M1pBac-R.
Tuy nhiên, việc phân tích bằng enzyme giới hạn chỉ cho ta biết là plasmid tái tổ hợp liệu đĩ cĩ mang đoạn gen ngoại lai hay khơng nhưng lại khơng thể cho biết gen đĩ cĩ gắn vào theo đúng chiều để cĩ thể dịch mã thành protein hay bị gắn ngược chiều. Vì vậy, song song với phân tích bằng enzyme
A
750bp 775bp
B 750bp
cắt giới hạn, 3 dịng plasmid pBluBacM1 được kiểm tra lại bằng PCR với cặp mồi “lai” với mồi xuơi (Polyhedrin forward sequencing primer) bám vào vector pBluBac4.5/V5-His-TOPO và mồi ngược (M1pBac-R) bám vào gen
m1. Bằng cặp mồi này với plasmid pBluBac4.5/V5-His-TOPO tái tổ hợp
mang hộp gen m1 gắn đúng chiều sẽ cho sản phẩm PCR đặc hiệu cĩ kích
thước theo tính tốn khoảng 895 bp (775 bp của gen m1 và 120 bp của
vector). Kết quả điện di (Hình 11B) cho thấy cả 4 dịng plasmid này đều mang hộp gen m1 gắn đúng chiều. Như vậy, hộp gen m1 được gắn vào vùng xen
giữa gen lacZ và ORF 1629. Đây là hai vị trí sẽ xảy ra sự trao đổi chéo trình tự tương đồng giữa pBluBac4.5/V5-His-TOPO và DNA của baculovirus để tạo virus baculovirus tái tổ hợp. Qúa trình này được mơ phỏng ở hình 3.5. Các plasmid này sẽ được sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo.