2.3.5.1. Nguồn nitơ
Các nguồn nit đ ợc kh o sát lƠ: bột bắp, bột đ u nƠnh, pepton, (NH4)2SO4,
urê với nồng độ kh o sát đ ợc thể hiện trong b ng 2.1. (Han và cs., 2011; Altaf và
cs., 2006)
SVTH: TRẦN THỊ KIỀU 29 ThƠnhăph n N ngăđ (g/L) Pepton 10 B tăb p 15 B tăđ uănƠnh 8 (NH4)2SO4 5 H2NCONH2 3
Môi tr ờng chọn lọc nguồn Nit tối u gồm có nguồn nit c n kh o sát, glucose
20 g/L vƠ các thƠnh ph n còn l i c a môi tr ờng MRS nh : tween 80, K2HPO4,
CH3CO2Na, MgSO4.7H2O, MnSO4.H2O.
2.3.5.2. Nguồn cacbon
Các nguồn cacbon đ ợc kh o sát là: succrose, maltose, lactose, glucose, m t r
đ ờng, bột bắp với khối l ợng kh o sát đ ợc trình bày trong b ng 2.2. (Altaf và cs., 2006; Farooq và cs., 2012; Han và cs., 2011; Magdalena và cs., 2010)
B ng 2.2. Các ngu n cacbon kh o sát
ThƠnhăph n Kh iăl ngă(g/L)
B tăb p 30 Glucose 20 Maltose 20 Succrose 20 M tăr ăđ ng 40 Lactose 20
Môi tr ờng chọn lọc nguồn cacbon tối u gồm có nguồn nit tối u, nguồn cacbon c n kh o sát và các thành ph n còn l i c a môi tr ờng MRS: tween 80, MgSO4, K2HPO4, CH3COONa, MnSO4.
SVTH: TRẦN THỊ KIỀU 30
Kh o sát các nguồn khoáng: CaCl2, NaCl, CaCO3, MgSO4.7H2O, K2HPO4, KH2PO4 với khối l ợng đ ợc trình bày trong b ng 2.3.(Han và cs., 2011; Altaf và cs., 2006)
B ng 2.3. Các ngu n khoáng kh o sát
ThƠnhăph n Kh iăl ngă(g/L)
K2HPO4 0.5 KH2PO4 0.5 CaCO3 0.5 NaCl 0.5 CaCl2 0.5 MgSO4.7H2O 0.5
Môi tr ờng chọn lọc nguồn khoáng tối u bao gồm nguồn nit tối u (10 g/L),
nguồn cacbon tối u (20 g/L), và nguồn khoáng c n kh o sát.
Ti n hành
Ch ng L. plantarum NT 1.5 đ ợc tăng sinh trên môi tr ờng MRS ở 37oC, 5% CO2, 24 giờ.
Đi u ch nh d ch khuẩn v 108 t bƠo/ mL sau đó bổ sung 1mL d ch khuẩn vào 20
mL môi tr ờng kh o (pH, nhiệt độ theo k t qu m c 2.3.4.) trong kho ng thời gian (theo k t qu m c 2.3.3), 5% CO2.
Sau thời gian nuôi c y đo m t độ t bào L. plantarum NT 1.5 bằng ph ng pháp
đo độđ c ởb ớc sóng 610 nm.
Các thử nghiệm đ ợc lặp l i 3 l n, k t qu đ ợc xử lỦ thống kê ANOVA một y u tố bằng ph n m m Statgraphics Plus 3.0 vƠ ph n m m Excel. K t qu đ ợc trình bƠy d ới d ng trung bình ± sai số.
2.3.6. Thi t k thí nghi m tìm y u t nhă h ngă đ n quá trình lên men tĕngăsinh kh i theo thi t k Plackett- Burman
SVTH: TRẦN THỊ KIỀU 31
Mục đích
Xác đnh các y u tố quan trọng nh h ởng chính đ n quá trình lên men thu sinh khối c a ch ng vi khuẩn L. plantarum NT 1.5.
Thiết kế thí nghiệm Plackett – Burman
Thi t k thí nghiệm theo ma tr n Plackett ậ Burman với các y u tố gồm có: nguồn nit , cacbon vƠ các nguồn khoáng đư đ ợc chọn ở m c 2.4.
Mỗi y u tốđ ợc kh o sát ở 2 mức độ: mức độ cao (+1) và mức độ th p (-1). Thi t k đ ợc bố trí dựa theo ph ng pháp qui ho ch thực nghiệm bằng ph n m m thống kê Minitab 16.2.0 c a Minitab Inc., USA để ớc tính các giá tr t-value, p- value và mức độ tin c y.
Thực hiện :
Tăng sinh ch ng L. plantarum trên 20 mL môi tr ờng MRS ở 37oC, 24-48 giờ.
Đi u ch nh d ch khuẩn đ t giá tr OD610 có m t độ t bào kho ng 108 t bào/mL. Bổ sung 1 mL d ch khuẩn vƠo 20 mL môi tr ờng kh o sát.
Nuôi vi khuẩn ở nhiệt độ kh o sát theo m c 2.3.4., 5% CO2. Sau thời gian nuôi c y d ch khuẩn đ ợc đo OD610đểxác đ nh m t độ t bào.
Mỗi nghiệm thức c a thí nghiệm đ ợc thực hiện với 3 l n lặp l i.
K t qu
Số liệu k t qu thí nghiệm đ ợc thống kê bằng ph n m m Minitab 16.2.0
nh h ởng c a các y u tố đ n sinh khối ch ng vi khuẩn đ ợc mô t qua
ph ng trình hồi quy b c nh t:
iXi
Y 0
Dựa vào phân tích hồi quy, n u mức Ủ nghĩa đ t trên 95% (p < 0,05), thì y u tố đó đ ợc cho là có nh h ởng chính đ n sự tăng sinh khối t bào và với k t qu thu ti p t c thực hiện các thí nghiệm ti p theo để xác đnh giá tr tối u cho sự gia tăng sinh
SVTH: TRẦN THỊ KIỀU 32 2.3.7. Thí nghi m kh iăđ u
Thi t k thí nghiệm d ng đ y đ 22, có bổsung thêm điểm thí nghiệm trung tâm. Mỗi y u tố đ ợc kh o sát ở 3 c p độ: mức độ cao (+1) và mức độ th p (-1) và mức trung tâm (0). Thi t k đ ợc bố trí dựa theo ph ng pháp quy ho ch thực nghiệm bằng ph n m m thống kê Minitab 16.2.0 c a Minitab Inc., USA. Thí nghiệm đ ợc lặp l i 3 l n.
Ti n hành
T ng tự m c 2.3.6
2.3.8. Tìm kho ng t iă uă c a các y u t nhă h ng chính bằngă ph ngă pháp leo d c
2.3.8.1. Thiết kế thí nghiệm
N u k t qu c a b ớc khởi đ u cho th y có thể mô t hàm m c tiêu bằng một hàm hồi quy b c nh t, đi u đó chứng tỏ vùng thí nghiệm kh o sát còn ở xa vùng cực tr . Ti n hành các thí nghiệm leo dốc nhằm xác đnh vùng cực tr . Các thông số cho
ph ng pháp nƠy đ ợc tính toán thông qua hệ số hồi quy từ ph ng trình hồi quy c a thí nghiệm khởi đ u.
Từ mức c sở c a các y u tố này và các hệ số hồi quy, các b ớc chuyển động s
đ ợc tính nh sau:
Chọn b ớc chuyển động ứng với y u tố có giá tr tuyệt đối c a hệ số hồi qui lớn nh t vƠ tính toán các b ớc chuyển động còn l i bằng các công thức:
Trong đó:
: Kho ng bi n thiên.
: Hệ số hồi qui c a y u tố x1. : B ớc chuyển động c a y u tố x1.
SVTH: TRẦN THỊ KIỀU 33
Từ k t qu tính toán b ớc chuyển động c a từng y u tố nh h ởng, thí nghiệm bắt đ u từ mức trung tâm c a các y u tố nh h ởng chính. (Nguyễn Văn Dự và cs., 2011)
2.3.8.2. Tiến hành
T ng tự m c 2.3.6.
2.3.9. Thí nghi m b m t ch tiêuăxácăđ nh giá tr t iă uăc a các y u t nh h ng chính. h ng chính.
Từ k t qu thí nghiêm leo dốc, ti n hành thi t k thí nghiệm Box-Behnken để tìm giá tr tối u c a các y u tố nh h ởng chính.
2.3.9.1. Thiết kế thí nghiệm
Mỗi y u tốđ ợc kh o sát ở 3 mức độ: mức độ cao (+1), mức độ th p (-1) và mức
độ trung tâm (0) dựa theo k t qu ở m c 2.3.8.
Thi t k đ ợc bố trí dựa theo ph ng pháp quy ho ch thực nghiệm bằng ph n m m thống kê Minitab 16.2.0 c a Minitab Inc., USA.
2.3.9.2. Tiến hành
T ng tự m c 2.3.6.
2.3.10. Xácăđ nh th iăgianătĕngătr ng c a ch ng L. plantarum NT1.5 trên
môiătr ng t iă u
Sau khi xác đ nh đ ợc môi tr ờng vƠ đi u kiện nuôi c y tối u cho sinh khối cao nh t chúng tôi ti n hành kiểm đ nh k t qu và kh o sát l i thời gian tăng tr ởng tối u
nh t c a ch ng vi khuẩn trên môi t ờng kh o sát ở nhiệt độ theo m c 2.3.4, 5% CO2.
SVTH: TRẦN THỊ KIỀU 34 CHƯƠNGă3:
K T QU NGHIÊN C U
SVTH: TRẦN THỊ KIỀU 35 3.1 K T QU XÂY DỰNG ĐƯỜNGăTƯƠNGăQUANăGI A MẬT ĐỘ T BÀO VI KHU N VÀ GIÁ TRỊ OD610
Đểcó đ ợc đ ờng t ng quan tuy n tính giữa OD610 và m t độ t bào
Lactobacillus plantarum NT 1.5 trên môi tr ờng MRS, chúng tôi ti n xác đ nh m t
độ vi khuẩn ở những giá tr đo OD610 t ng ứng. K t qu xây dựng đ ờng t ng
quan giữa m t độ t bào vi khuẩn và giá tr OD610 đ ợc trình bày trong b ng 3.1 và
đồ th 3.1.
B ng 3.1: Giá tr đoăOD610 và m tăđ t bào (Log(N/mL)
OD610nm 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 S khu n l c bình quân (CFU/ mL) 7,2.10 6 1,31.107 1,98.107 2,5.107 3,3.107 Log (N/ mL) 6,857 7,117 7,297 7,398 7,519
Đ th 3.1.ăĐ ngăt ngăquanătuy n tính gi a OD610 và m tăđ t bào
Lactobacillus plantarum NT 1.5 trênămôiătr ng MRS
Qua kh o sát quá trình nuôi c y c a ch ng L. plantarum NT 1.5 trong 24 giờ đ ợc trình bày trên b ng và biểu đồ chúng tôi nh n th y rằng m t độ t bào c a vi khuẩn L. plantarum NT1.5 trong huy n phù t bƠo t ng quan tuy n tính với các
y = 1.603x + 6.7566 R² = 0.9617 6.800 6.900 7.000 7.100 7.200 7.300 7.400 7.500 7.600 0 0.2 0.4 0.6 lo g (N/m L) Giáătr ăOD610 log(N/mL)
SVTH: TRẦN THỊ KIỀU 36
giá tr OD610nm từ 0,1 ậ0,5 theo ph ng trình y = 1,603x + 6,7566 với mức độ tin c y 96,17%.
3.2 K T QU XÂY DỰNGăĐƯỜNGăCONGăTĔNGăTRƯỞNG CỦA
L. PLANTARUM NT 1.5
Dựa vào k t qu xây dựng đ ờng t ng quan giữa m t độ t bào vi khuẩn và giá tr OD610 chúng tôi ti n hành xây dựng đ ờng cong tăng tr ởng tr ởng c a
ch ng Lactobacillus plantarum NT1.5. Sựtăng tr ởng c a ch ng Lactobacillus plantarum NT1.5 đ ợc theo dõi t i các thời điểm kh o sát bằng cách đo OD610 theo những mốc thời gian nuôi c y. K t qu đ ợc trình bày trong b ng 3.2 và đồ th 3.2.
B ng 3.2. Giá tr OD610 theo th i gian
Th iăgiană(gi ) Giáătr ăOD610 Log (N/mL) 0 0,023 ± 0,001 6,800 3 0,145 ± 0,000 6,990 6 0,369 ± 0,000 7349 9 0,625 ± 0,000 7,758 12 1,556 ± 0,003 9,250 15 1,944 ± 0,000 9,873 18 2,111 ± 0,000 10,141 21 2,084 ± 0,000 10,097 24 2,078 ± 0,000 10,088 27 2,070 ± 0,000 10,075 30 2,049 ± 0,000 10,041 33 2,036 ± 0,000 10,021 36 2,035 ± 0,000 10,019 39 2,013 ± 0,000 9,983
SVTH: TRẦN THỊ KIỀU 37 42 1,994 ± 0,000 9,952 45 1,993 ± 0,000 9,954 48 1,988 ± 0,000 9,944 51 1,971 ± 0,000 9,916 54 1,967 ± 0,000 9,910 57 1,935 ± 0,002 9,859 60 1,848 ± 0,000 9,719 63 1,806 ± 0,005 9,652 66 1,703 ± 0,000 9,486 69 1,615 ± 0,000 9,345 72 1,470 ± 0,016 9,114
Đ th 3.2.ăĐ ngăcongătĕngătr ng c a L. plantarum NT 1.5 theo th i gian
trênămôiătr ng MRS
Dựa vào b ng k t qu giá tr OD (b ng 3.2) và đồ th đ ờng cong tăng tr ởng
c a L. plantarum NT 1.5 trên môi tr ờng MRS (đồ th 3.2) chúng tôi nh n th y rằng thời gian từ 0 giờđ n 6 giờ là thời gian vi khuẩn b ớc vào pha ti m tàng (pha Lag) thời gian này vi khuẩn tăng sinh r t ít (log có giá tr từ 6,800 đ n 7,349). Từ 6 giờ đ n 18 giờ vi khuẩn tăng sinh m nh nh t (log có giá tr từ 7,349 đ n 10,141) đơy lƠ
0.000 2.000 4.000 6.000 8.000 10.000 12.000 0h 3h 6h 9h 12h 15h 18h 21h 24h 27h 30h 33h 36h 39h 42h 45h 48h 51h 54h 57h 60h 63h 66h 69h 72h Lo g (N / m L)
SVTH: TRẦN THỊ KIỀU 38
thời gian thu đ ợc nhi u sinh khối vi khuẩn nh t. Vi khuẩn b ớc vào pha cân bằng trong thời gian 18 đ n 60 giờ (log có giá tr từ 10,141 đ n 9,719). Sau 60 giờ vi khuẩn r i vƠo pha suy tƠn.
Từ k t qu trên chúng tôi chọn 18 giờ (log = 10,141 N/ mL) là thời gian thích hợp nh t để thu nh n sinh khối c a L. plantarum NT 1.5.
3.3 K T QU KH O SÁT NHIỆTăĐỘ, pH THÍCH H P CHO SỰTĔNGăTRƯỞNG CỦA L. PLANTARUM NT1.5. TĔNGăTRƯỞNG CỦA L. PLANTARUM NT1.5.
Từ k t qu xây dựng đ ờng t ng quan giữa m t độ t bào vi khuẩn và giá tr OD610, đ ờng cong tăng tr ởng tr ởng ch ng Lactobacillus plantarum NT 1.5,
chúng tôi ti n hành kh o sát nh h ởng c a nhiệt độ nuôi c y và pH môi tr ờng đ n sựtăngtr ởng c a L. plantarum NT1.5. K t qu đ ợc thể hiện bằng giá tr Log (N/ mL) c a mỗi nhiệt độ t i pH t ng ứng.
K t qu kh o sát đ ợc trình bày trong b ng 3.3 vƠ đồ th 3.3.
B ng 3.3. M tăđ t bào Lactobacillus plantarum NT1.5 (Log (N/ mL)) t i
m i giá tr nhi tăđ vƠăđ pH kh o sát
pH = 4 pH = 5 pH = 6 pH = 7 pH = 8
30oC 7,605± 0,027 8,724± 0,174 9,782± 0,034 9,990 ± 0,025 9,352± 0,129
37oC 8,588± 0,167 9,389± 0,136 9,942± 0,020 10,011 ± 0,014 9,677± 0,007
SVTH: TRẦN THỊ KIỀU 39 Đ th 3.3. nhăh ng c a nhi tăđ vƠăđ pH lên s tĕngătr ng c a
Lactobacillus plantarum NT1.5
Dựa vào b ng 3.3 và đồ th 3.3 chúng tôi th y rằng t i pH=4 và 40oC
Lactobacillus plantarum NT1.5 tăng tr ởng th p nh t (Log =7,605±0,027) và cao nh t ở 37oC và pH 7 (log (N/mL) = 10,011 ± 0,001). Nh v y chúng tôi chọn pH=7 và nhiệt độ 37oC lƠ đi u kiện nuôi c y thích hợp cho L.pantarum NT1.5 cho các thí
nghiệm ti p theo.
3.4 K T QU SÀNG LỌC Y U TỐ DINHăDƯ NG
Từ những k t qu có đ ợc ở các thí nghiệm tr ớc (xây dựng đ ờng t ng
quan giữa m t độ t bào vi khuẩn và giá tr OD610, đ ờng cong tăng tr ởng tr ởng , k t qu kh o sát nh h ởng c a nhiệt độvƠ pH đ n sựtăng tr ởng c a L.
plantarum), chúng tôi ti n đ n b ớc sàng lọc các y u tốdinh d ỡng nh h ởng đ n sựsinh tr ởng c a ch ng L. plantarum. Các nguồn dinh d ỡng kh o sát gồm có: nguồn nit , nguồn cacbon, nguồn khoáng.
3.4.1. Ngu n nit
Chúng tôi ti n hành kh o sát các nguồn nit : pepton, bột đ u nành, bột bắp, (NH4)2SO4, Urê với khói l ợng mỗi nguồn đ ợc thể hiện trong b ng 2.1 (m c
2.3.5.1). 0 2 4 6 8 10 12 pH = 4 pH = 5 pH = 6 pH = 7 pH = 8 Lo g (N / m L) 30oC 37oC 40oC
SVTH: TRẦN THỊ KIỀU 40
nh h ởng c a các nguồn nit kh o sát đ n sinh tr ởng c a L. plantarum
NT1.5 đ ợc xác đ nh thông qua giá tr Log (N/ mL). K t qu thí nghiệm đ ợc thể
hiện trong b ng 3.4 vƠ đồ th 3.4.
B ng 3.4. Giá tr log (N/ mL) c a các ngu n nit kh o sát Ngu năNit Log (N/ mL) M tăđ ă(CFU/ămL)
B tăb p 7,193 ± 0,051c 1,5.107 Pepton 8,721 ± 0,164a 5,2.108 B tăđ uănƠnh 7,644 ± 0,164b 4,4.107 (NH4)2SO4 7,265 ± 0,021c 1,107 Urê 7,381 ± 0,012c 1.8.107 Trong cùng một cột các chỉ số có cùng mẫu tự không có sự khác biệt ở mức ý
nghĩa 5% qua phép thử Duncan.
Đ th 3.4. K t qu kh o sát ngu n nit
Theo k t qu thí nghiệm b ng 3.4 và biểu đồ 3.4 chúng tôi nh n th y rằng:
Giữa các số liệu có sự khác biệt Ủ nghĩa với độ tin c y p < 0,05 (ph l c 2). Trong các nguồn nit (hữu c vƠ vô c ) thì nguồn nit hữu c nh h ởng đ n m t độ vi khuẩn cao h n các nguồn nit vô c . Pepton cho m t độ vi khuẩn cao nh t (Log (N/ mL) = 8,721 ± 0,081), th p nh t là bột bắp (Log (N/ mL) = 7,193 ± 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
bot bap pepton bột đ u nƠnh (NH4)2SO4 URE
Lo g (M / m L)
SVTH: TRẦN THỊ KIỀU 41
0,008. Vì v y, pepton đ ợc chọn là nguồn nit tốt nh t cho s n xu t sinh khối c a
L. plantarum NT1.5.
3.4.2. Ngu n cacbon
Từ k t qu m c 3.4.1 chúng tôi ti p t c kh o sát các nguồn cacbon. Môi
tr ờng kh o sát gồm có pepton, các nguồn khoáng c a môi tr ờng MRS và các nguồn cacbon c n kh o sat.
Các nguồn cacbon c n kh o sát là: succrose, maltose, glucose, lactose, m t r đ ờng, bột bắp với khối l ợng mỗi nguồn đ ợc trình bƠy trong b ng 2.2 (m c
2.5.3.2).
nh h ởng c a các nguồn cacbon kh o sát đ n sự sinh tr ởng c a L.plantarun
NT1.5 đ ợc xác đnh thông qua giá tr Log (N/ mL). K t qu thí nghiệm đ ợc trình bày trong b ng 3.5 và biểu đồ 3.5.
B ng 3.5. Giá tr log (N/ mL) c a các ngu n cacbon kh o sát Ngu năCacbon Log (N/ mL) M tăđ ă(CFU/ămL) Ngu năCacbon Log (N/ mL) M tăđ ă(CFU/ămL)
Succrose 8,586 ± 0,057c 3,9.108 Maltose 9,519 ± 0,007a 3,0.109 Glucose 9,155 ± 0,014b 10,5.109 Lactose 7,198 ± 0,020d 1,6.107 M tăr ăđ ng 9,252 ± 0,093b 1.8.109 B tăb p 6,912 ± 0,012e 8,2.106 Trong cùng một cột các chỉ số có cùng mẫu tự không có sự khác biệt ở mức ý
SVTH: TRẦN THỊ KIỀU 42