ThƠnhăph n Kh iăl ngă(g/L)
K2HPO4 0.5 KH2PO4 0.5 CaCO3 0.5 NaCl 0.5 CaCl2 0.5 MgSO4.7H2O 0.5
Môi tr ờng chọn lọc nguồn khoáng tối u bao gồm nguồn nit tối u (10 g/L),
nguồn cacbon tối u (20 g/L), và nguồn khoáng c n kh o sát.
Ti n hành
Ch ng L. plantarum NT 1.5 đ ợc tăng sinh trên môi tr ờng MRS ở 37oC, 5% CO2, 24 giờ.
Đi u ch nh d ch khuẩn v 108 t bƠo/ mL sau đó bổ sung 1mL d ch khuẩn vào 20
mL môi tr ờng kh o (pH, nhiệt độ theo k t qu m c 2.3.4.) trong kho ng thời gian (theo k t qu m c 2.3.3), 5% CO2.
Sau thời gian nuôi c y đo m t độ t bào L. plantarum NT 1.5 bằng ph ng pháp
đo độđ c ởb ớc sóng 610 nm.
Các thử nghiệm đ ợc lặp l i 3 l n, k t qu đ ợc xử lỦ thống kê ANOVA một y u tố bằng ph n m m Statgraphics Plus 3.0 vƠ ph n m m Excel. K t qu đ ợc trình bƠy d ới d ng trung bình ± sai số.
2.3.6. Thi t k thí nghi m tìm y u t nhă h ngă đ n quá trình lên men tĕngăsinh kh i theo thi t k Plackett- Burman
SVTH: TRẦN THỊ KIỀU 31
Mục đích
Xác đnh các y u tố quan trọng nh h ởng chính đ n quá trình lên men thu sinh khối c a ch ng vi khuẩn L. plantarum NT 1.5.
Thiết kế thí nghiệm Plackett – Burman
Thi t k thí nghiệm theo ma tr n Plackett ậ Burman với các y u tố gồm có: nguồn nit , cacbon vƠ các nguồn khoáng đư đ ợc chọn ở m c 2.4.
Mỗi y u tốđ ợc kh o sát ở 2 mức độ: mức độ cao (+1) và mức độ th p (-1). Thi t k đ ợc bố trí dựa theo ph ng pháp qui ho ch thực nghiệm bằng ph n m m thống kê Minitab 16.2.0 c a Minitab Inc., USA để ớc tính các giá tr t-value, p- value và mức độ tin c y.
Thực hiện :
Tăng sinh ch ng L. plantarum trên 20 mL môi tr ờng MRS ở 37oC, 24-48 giờ.
Đi u ch nh d ch khuẩn đ t giá tr OD610 có m t độ t bào kho ng 108 t bào/mL. Bổ sung 1 mL d ch khuẩn vƠo 20 mL môi tr ờng kh o sát.
Nuôi vi khuẩn ở nhiệt độ kh o sát theo m c 2.3.4., 5% CO2. Sau thời gian nuôi c y d ch khuẩn đ ợc đo OD610đểxác đ nh m t độ t bào.
Mỗi nghiệm thức c a thí nghiệm đ ợc thực hiện với 3 l n lặp l i.
K t qu
Số liệu k t qu thí nghiệm đ ợc thống kê bằng ph n m m Minitab 16.2.0
nh h ởng c a các y u tố đ n sinh khối ch ng vi khuẩn đ ợc mô t qua
ph ng trình hồi quy b c nh t:
iXi
Y 0
Dựa vào phân tích hồi quy, n u mức Ủ nghĩa đ t trên 95% (p < 0,05), thì y u tố đó đ ợc cho là có nh h ởng chính đ n sự tăng sinh khối t bào và với k t qu thu ti p t c thực hiện các thí nghiệm ti p theo để xác đnh giá tr tối u cho sự gia tăng sinh
SVTH: TRẦN THỊ KIỀU 32 2.3.7. Thí nghi m kh iăđ u
Thi t k thí nghiệm d ng đ y đ 22, có bổsung thêm điểm thí nghiệm trung tâm. Mỗi y u tố đ ợc kh o sát ở 3 c p độ: mức độ cao (+1) và mức độ th p (-1) và mức trung tâm (0). Thi t k đ ợc bố trí dựa theo ph ng pháp quy ho ch thực nghiệm bằng ph n m m thống kê Minitab 16.2.0 c a Minitab Inc., USA. Thí nghiệm đ ợc lặp l i 3 l n.
Ti n hành
T ng tự m c 2.3.6
2.3.8. Tìm kho ng t iă uă c a các y u t nhă h ng chính bằngă ph ngă pháp leo d c
2.3.8.1. Thiết kế thí nghiệm
N u k t qu c a b ớc khởi đ u cho th y có thể mô t hàm m c tiêu bằng một hàm hồi quy b c nh t, đi u đó chứng tỏ vùng thí nghiệm kh o sát còn ở xa vùng cực tr . Ti n hành các thí nghiệm leo dốc nhằm xác đnh vùng cực tr . Các thông số cho
ph ng pháp nƠy đ ợc tính toán thông qua hệ số hồi quy từ ph ng trình hồi quy c a thí nghiệm khởi đ u.
Từ mức c sở c a các y u tố này và các hệ số hồi quy, các b ớc chuyển động s
đ ợc tính nh sau:
Chọn b ớc chuyển động ứng với y u tố có giá tr tuyệt đối c a hệ số hồi qui lớn nh t vƠ tính toán các b ớc chuyển động còn l i bằng các công thức:
Trong đó:
: Kho ng bi n thiên.
: Hệ số hồi qui c a y u tố x1. : B ớc chuyển động c a y u tố x1.
SVTH: TRẦN THỊ KIỀU 33
Từ k t qu tính toán b ớc chuyển động c a từng y u tố nh h ởng, thí nghiệm bắt đ u từ mức trung tâm c a các y u tố nh h ởng chính. (Nguyễn Văn Dự và cs., 2011)
2.3.8.2. Tiến hành
T ng tự m c 2.3.6.
2.3.9. Thí nghi m b m t ch tiêuăxácăđ nh giá tr t iă uăc a các y u t nh h ng chính. h ng chính.
Từ k t qu thí nghiêm leo dốc, ti n hành thi t k thí nghiệm Box-Behnken để tìm giá tr tối u c a các y u tố nh h ởng chính.
2.3.9.1. Thiết kế thí nghiệm
Mỗi y u tốđ ợc kh o sát ở 3 mức độ: mức độ cao (+1), mức độ th p (-1) và mức
độ trung tâm (0) dựa theo k t qu ở m c 2.3.8.
Thi t k đ ợc bố trí dựa theo ph ng pháp quy ho ch thực nghiệm bằng ph n m m thống kê Minitab 16.2.0 c a Minitab Inc., USA.
2.3.9.2. Tiến hành
T ng tự m c 2.3.6.
2.3.10. Xácăđ nh th iăgianătĕngătr ng c a ch ng L. plantarum NT1.5 trên
môiătr ng t iă u
Sau khi xác đ nh đ ợc môi tr ờng vƠ đi u kiện nuôi c y tối u cho sinh khối cao nh t chúng tôi ti n hành kiểm đ nh k t qu và kh o sát l i thời gian tăng tr ởng tối u
nh t c a ch ng vi khuẩn trên môi t ờng kh o sát ở nhiệt độ theo m c 2.3.4, 5% CO2.
SVTH: TRẦN THỊ KIỀU 34 CHƯƠNGă3:
K T QU NGHIÊN C U
SVTH: TRẦN THỊ KIỀU 35 3.1 K T QU XÂY DỰNG ĐƯỜNGăTƯƠNGăQUANăGI A MẬT ĐỘ T BÀO VI KHU N VÀ GIÁ TRỊ OD610
Đểcó đ ợc đ ờng t ng quan tuy n tính giữa OD610 và m t độ t bào
Lactobacillus plantarum NT 1.5 trên môi tr ờng MRS, chúng tôi ti n xác đ nh m t
độ vi khuẩn ở những giá tr đo OD610 t ng ứng. K t qu xây dựng đ ờng t ng
quan giữa m t độ t bào vi khuẩn và giá tr OD610 đ ợc trình bày trong b ng 3.1 và
đồ th 3.1.
B ng 3.1: Giá tr đoăOD610 và m tăđ t bào (Log(N/mL)
OD610nm 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 S khu n l c bình quân (CFU/ mL) 7,2.10 6 1,31.107 1,98.107 2,5.107 3,3.107 Log (N/ mL) 6,857 7,117 7,297 7,398 7,519
Đ th 3.1.ăĐ ngăt ngăquanătuy n tính gi a OD610 và m tăđ t bào
Lactobacillus plantarum NT 1.5 trênămôiătr ng MRS
Qua kh o sát quá trình nuôi c y c a ch ng L. plantarum NT 1.5 trong 24 giờ đ ợc trình bày trên b ng và biểu đồ chúng tôi nh n th y rằng m t độ t bào c a vi khuẩn L. plantarum NT1.5 trong huy n phù t bƠo t ng quan tuy n tính với các
y = 1.603x + 6.7566 R² = 0.9617 6.800 6.900 7.000 7.100 7.200 7.300 7.400 7.500 7.600 0 0.2 0.4 0.6 lo g (N/m L) Giáătr ăOD610 log(N/mL)
SVTH: TRẦN THỊ KIỀU 36
giá tr OD610nm từ 0,1 ậ0,5 theo ph ng trình y = 1,603x + 6,7566 với mức độ tin c y 96,17%.
3.2 K T QU XÂY DỰNGăĐƯỜNGăCONGăTĔNGăTRƯỞNG CỦA
L. PLANTARUM NT 1.5
Dựa vào k t qu xây dựng đ ờng t ng quan giữa m t độ t bào vi khuẩn và giá tr OD610 chúng tôi ti n hành xây dựng đ ờng cong tăng tr ởng tr ởng c a
ch ng Lactobacillus plantarum NT1.5. Sựtăng tr ởng c a ch ng Lactobacillus plantarum NT1.5 đ ợc theo dõi t i các thời điểm kh o sát bằng cách đo OD610 theo những mốc thời gian nuôi c y. K t qu đ ợc trình bày trong b ng 3.2 và đồ th 3.2.