4.4.1 Mơi trường Hansen đặc (MT1).
Glucose 50g Agar 20g Pepton 10g Nước cất vừa đủ 1000ml KH P0 3g pH=5,5
4.4.2 Mơi trường Hansen lỏng (MT2).
Thành phần giống MT1 nhưng khơng cĩ agar.
4.4.3 Mơi trường hoạt hĩa (MT3).
Cao malt 30g Nước cất 1000ml Pepton 5g pH=5,5
4.4.4 Mơi trường nhân giống (MT4).
Cao nấm men 1g KH2PO4 3g Glucose 50g Nước cất 1000ml Pepton 10g pH = 6
4.4.5 Mơi trường thử khả năng lên men các nguồn hydratcacbon (MT5).
Nước chiết giá đậu 1000ml. Bổ sung đường nghiên cứu 2%.
Cách pha chế nước chiết giá đậu: Giá đậu rửa sạch, để ráo nước, cân 200g giá và 1000ml nước, đun sơi 30 phút, lọc lấy phần dịch trong. Thêm cho đủ 1000ml, bổ sung đường nghiên cứu 2%.
4.4.6 Mơi trường xác định khả năng sinh bào tử (MT6).
Glucose 0,4g Agar 16g Acetat khơng ngậm nước 1,4g Nước cất 1000ml.
4.4.7 Mơi trường thạch-pepton-glucose (MT7)
Pepton 10g Agar 20g Glucose 20g Nước cất 1000ml.
4.4.8 Mơi trường xác định khả năng sử dụng các nguồn nitơ khác nhau (MT8).
Glucose 20g Agar 16g KH2PO4 1g Nước cất 1000ml MgSO .7H O 0,5g
Khi muốn xác định khả năng sử dụng các nguồn nitơ khác nhau thì bổ sung nguồn nitơ vào mơi trường vơ đạm (MT8) dưới dạng KN03, (NH4)2S04 hoặc Pepton với các tỷ lệ khác nhau theo yêu cầu của thí nghiệm.
4.4.9 Mơi trường xác định khả năng kết lắng của tế bào nấm men (MT9).
CaSO4 0,51g CH3COONa 6,8g
CH3COOH 4,05g Nước cất 1000ml
4.4.10 Mơi trường MPA – agar (MT10)
Cao thịt 3g Agar 16g
NaCl 5g Nước cất 1000ml Pepton 10g
4.4.11 Mơi trường MPA-dịch thể (MT11)
Thành phần giống MT10 nhưng khơng cĩ agar.
4.4.12 Mơi trường sirơ thanh long (MT12)
Chọn trái thanh long cịn tươi, cĩ màu đỏ đậm, tai lá cịn xanh, khơng bị dập nát. Lột vỏ, cắt thành miếng mỏng cho vào bình thủy tinh, cứ một lớp thanh long phủ một lớp đường. Thường 1kg thanh long sử dụng ½ kg đường. Ta thu được dịch chiết sau 7-10 ngày. Dịch chiết này cĩ nồng độ đường rất cao nên cần pha lỗng 2-4 lần bằng nước sơi để nguội nhằm đạt được độ đường phù hợp. Sau đĩ điều chỉnh độ chua bằng acid citric 5%.
Đem khử trùng dịch theo kiểu Pasteur ở 700C trong 15-20 phút.
4.4.13 Mơi trường dịch trái thanh long
Chọn thanh long tương tự như trên, lột bỏ vỏ rồi cắt thành từng miếng cho vào máy ép trái cây. Thu được dịch trái thanh long khơng qua lọc (MT14). Lượng dịch thu được đem lọc để lấy phần dịch trong-dịch trái thanh long qua lọc (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
(MT13). Thường 1kg trái thanh long thu được khoảng 300-400ml dịch trái thanh long khơng qua lọc và 200-250ml dịch trái thanh long qua lọc.
Dịch trái thanh long nguyên chất độ đường khoảng 10-140Bx và pH = 4,0- 4,5 nên cần thêm đường và điều chỉnh pH=3,5 bằng acid citric. Sau đĩ đem khử trùng ở 700C trong 15-20 phút.
4.4.14 Mơi trường dịch trích ly trái thanh long (MT15)
Thịt trái thanh long được cắt miếng mỏng, nhỏ, bổ sung nước và đun vừa đến sơi, giữ trong 15 phút để các chất hịa tan vào mơi trường. Vớt bỏ xác bã thu được lượng dịch trích ly. Tùy theo lượng dịch thu được cĩ 3 mơi trường:
MT15-1: 1kg trái thanh long thu được 450ml dịch trích ly.
MT15-2: 1kg trái thanh long thu được 465ml dịch trích ly.
MT15-3: 1kg trái thanh long thu được 480ml dịch trích ly.
Dịch trích ly được bổ sung đường, acid citric và đem khử trùng Pasteur ở 700C trong 15-20 phút.
4.4.15 Mơi trường nhân giống thích hợp để lên men dịch trái thanh long (MT16).
Dịch trái thanh long khơng qua lọc được bổ sung đường sacarose đến 180Bx, chỉnh pH bằng acid citric về 3,5 và bổ sung (NH4)2SO4 5g/l.
4.4.15 Mơi trường lên men (MT17)
Dịch trái thanh long khơng qua lọc được bổ sung đường sacarose đến 200Bx, điều chỉnh pH bằng acid citric đến 3,5. Trong 1 lít nước quả boå sung 10mg/l hỗn hợp cĩ amon Sulfat 100 g/l và vitamin B1 (Thiamin) 0,25 g/l.
CHƯƠNG 5: CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 5.1 Các phương pháp vi sinh vật
5.1.1 Phân lập và thuần khiết giống theo phương pháp pha lỗng của Koch [5] [50] [51].
* Nguyên tắc: mục đích để tách rời một loại tế bào từ quần thể vi sinh vật ban đầu, sau đĩ gieo cấy trên đĩa petri với mơi trường dinh dưỡng chọn lọc và ủ ở điều kiện thích hợp. Mỗi tế bào này hình thành nên khuẩn lạc đơn riêng biệt (chỉ chứa một loại tế bào mới gọi là khuẩn lạc thuần) [50].
* Tiến hành: [5]
Nếu mẫu là cơ chất dạng rắn: cân 1g mẫu cho vào cối sứ nghiền nát. Sau đĩ chuyển vào bình tam giác chứa 99ml nước cất vơ trùng, lắc đều được độ pha lỗng 10-2.
Nếu mẫu là cơ chất dạng lỏng hay sệt: dùng pipet vơ trùng hút 1ml mẫu chuyển vào bình tam giác chứa 99ml nước cất vơ trùng, lắc đều được độ pha lỗng 10-2.
Tiếp tục pha lỗng cho tới hệ số pha lỗng thích hợp theo sơ đồ 5.1 [22] Sơ đồ 5.1 Phương pháp pha lỗng mẫu
Tiến hành phân lập mẫu ở độ pha lỗng thích hợp trên mơi trường MT1 ở thạch đĩa và nuơi ở 300C trong 3 ngày. Chọn các khuẩn lạc riêng lẽ, cấy ra thạch nghiêng mơi trường MT1. Nếu khơng thuần thì làm thuần bằng phương pháp cấy trang và kiểm tra hình thái tế bào dưới kính hiển vi.
5.1.2 Phương pháp nghiên cứu hình thái tế bào [5] [6] [29] [50] [51]. 5.1.2.1 Quan sát hình thái
Quan sát đại thể: quan sát khuẩn lạc trên kính hiển vi sơi nổi.
Quan sát vi thể: quan sát tế bào dưới kính hiển vi quang học với vật kính ×40, ×100.
5.1.2.2 Đo kích thước tế bào: bằng trắc vi thị kính.
5.1.2.3 Phương pháp tính số lượng tế bào bằng phịng đếm Goriaep (phịng đếm hồng cầu)
* Nguyên tắc cấu tạo: phịng đếm là một phiến kính dày hình chữ nhật, giữa là phần lõm phẳng, tại đây cĩ kẻ một lưới gồm 400 hình vuơng cĩ diện tích tổng cộng là 1mm2. Vì vậy diện tích một hình vuơng nhỏ là 1/400mm2 và một hình vuơng lớn là 1/25mm2.
* Cơng thức tính:
N: Số lượng tế bào trong 1ml dịch huyền phù.
n s h a N . 1000 .
= a: Số lượng tế bào trung bình trong 1 ơ nhỏ. h: Chiều sâu của khung đếm. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
n: Độ pha lỗng của mẫu. s: Diện tích hình vuơng của lưới.
5.1.2.4 Phương pháp quan sát nang bào tử nấm men [5] [29] [52]
* Nguyên tắc: một số nấm men cĩ khả năng hình thành bào tử hay nang bào tử trong mơi trường nghèo dinh dưỡng nhằm bảo vệ nấm men chống lại nhiều ảnh hưởng cĩ hại của mơi trường.
* Tiến hành: cấy nấm men trên mơi trường MT6 từ 10-15 ngày, làm tiêu bản soi tươi để quan sát nang bào tử.
5.1.2.5 Phương pháp quan sát khuẩn ty [5] [52]
Phân phối mơi trường MT7 vào các đĩa petri một lớp càng mỏng càng tốt. Dùng que cấy đầu trịn lấy nấm men và cấy thành 3 đường thẳng song song. Dùng Panh gắp 1 lá kính ngâm trong cồn 700, đốt nhẹ cho hết cồn, để nguội rồi đặt nhẹ nhàng cẩn thận trên vết cấy.
Chú ý: Bề mặt thạch phải thật khơ, khi đậy lá kính mỏng phải tránh bọt khí, đậy xong phải tránh di chuyển làm xơ lệch lá kính.
Nuơi ở 28-300C từ 3-5 ngày, quan sát dưới kính hiển vi.
5.1.3 Nghiên cứu đặc điểm sinh lý, sinh hĩa
5.1.3.1 Khả năng đồng hĩa các nguồn nitơ khác nhau [5] [52]
Nuơi cấy nấm men trong 3 lơ ống nghiệm Lơ 1: chứa mơi trường vơ đạm (MT8)
Lơ 2: mơi trường MT8 cĩ bổ sung 0,1% KNO3 Lơ 3: mơi trường MT8 cĩ bổ sung 0,1% (NH4)2SO4
Quan sát vết cấy ở các lơ ống nghiệm sau 5-7 ngày nuơi cấy, lơ nào cĩ vết cấy chứng tỏ nấm men cĩ khả năng sử dụng nguồn nitơ đĩ để phát triển.
5.1.3.2 Phương pháp xác định khả năng lên men các nguồn hydratcacbon[5] [47] [52]
* Nguyên tắc: Sử dụng bình Einhorn-Smith để đánh giá hoạt lực lên men. Trong quá trình lên men sẽ sinh ra CO2, đẩy dịch lên men trong cột chia vạch xuống; cột khí CO2 càng cao chứng tỏ khả năng lên men càng mạnh.
* Tiến hành: Cho 9ml dung dịch mơi trường MT5 chứa các loại đường nghiên cứu 2% (Glucose, dextrin, sacarose, lactose, galactose và maltose) vào mỗi bình Einhorn-smith. Bổ sung 1ml giống vào, đậy nút bơng rồi dùng keo
parafilm quấn kín lên nắp bình. Theo dõi thời gian tạo ra 5ml khí CO2 trong bình để đánh giá hoạt lực lên men của mỗi chủng với mỗi loại đường khác nhau.
Chú ý: Các thí nghiệm bắt đầu bằng đường glucose. Nếu nấm men lên men được glucose thì tiếp tục thí nghiệm với các loại đường khác.
5.1.3.3 Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ [52]
* Nguyên tắc: dùng ống nghiệm cĩ mơi trường MT2 đã chứa sẵn ống thủy tinh nhỏ (ống Durham) cũng chứa đầy mơi trường và cĩ đáy quay lên phía trên để đánh giá khả năng sinh trưởng.
* Tiến hành: cấy nấm men vào ống nghiệm chứa mơi trường MT2 và chứa sẵn một ống Durham cũng chứa đầy mơi trường cĩ đáy quay lên phía trên. Nuơi ở nhiệt độ khác nhau: 100C, 200C, 300C, 350C và 400C. Quan sát trạng thái ống Durham sau mỗi ngày và theo dõi trong 3 ngày.
Ống Durham nổi lên: sinh trưởng mạnh Ống Durham lơ lững: sinh trưởng yếu
Ống Durham khơng cĩ khí: khơng sinh trưởng
5.1.3.4 Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của pH [52]
Cấy nấm men vào mơi trường MT2 điều chỉnh mơi trường bằng NaOH 0,1N hoặc bằng acid citric 5% về các giá trị pH: 2,5; 3,0; 3,5; 4,0; 4,5; 5,0; 5,5; 6,0 và 6,5. Nuơi cấy tĩnh ở 300C trong 3 ngày. Xác định khả năng sinh trưởng của chủng nấm men ở các trị số pH khác nhau dựa vào trạng thái của ống Durham như mục 5.1.3.3
5.1.3.5 Phương pháp khảo sát khả năng chịu cồn [52]
Thí nghiệm được tiến hành tương tự như mục 5.1.3.3 nhưng ống nghiệm cĩ chứa mơi trường MT2 cĩ bổ sung nồng độ cồn khác nhau: 1%, 2%, 3%, 4% và 5%. Quan sát trạng thái của ống Durham sau mỗi ngày và theo dõi khả năng sinh trưởng của chủng nấm men trong 3 ngày.
5.1.4 Phương pháp xác định hoạt lực lên men [7] [22]
Để xác định hoạt lực lên men của các chủng nấm men sử dụng phương pháp cân bình.
* Nguyên tắc: Khả năng lên men rượu được xác định bằng lượng CO2 thốt ra trong quá trình lên men theo phương pháp cân bình tại các thời điểm khác nhau. Lượng CO2 thốt ra làm giảm trọng lượng bình, trọng lượng bình càng giảm chứng tỏ chủng nấm men lên men càng mạnh. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
* Tiến hành:
Đưa các chủng nấm men vào nhân giống trên máy lắc 150 vịng/phút trong 24 giờ ở nhiệt độ phịng.
Phân phối 95ml mơi trường vào các bình tam giác 250ml, bổ sung dịch nhân giống với tỷ lệ 5% (cần điều chỉnh lượng giống cho vào bình lên men đều bằng nhau), đậy nút cao su đã vơ trùng cĩ nối ống thốt. Trong ống thốt cho H2SO4 đậm đặc hoặc glycerin để hấp thu lượng nước bốc hơi.
Xác định lượng CO2 thốt ra bằng cách cân bình tại các thời điểm 0giờ, 24 giờ, 48 giờ và 72 giờ.
5.1.5 Phương pháp kiểm tra độ kết lắng[16] [47]
* Nguyên tắc: Khả năng kết lắng của từng chủng nấm men được xác định bằng tốc độ lắng sinh khối.
* Tiến hành: Hịa sinh khối nấm men vào dung dịch đệm acetat đựng trong các ống nghiệm bằng nhau. Lắc kỹ trong 1 phút, để lắng 15 phút. Nhận xét kết quả lắng theo chiều cao sinh khối nấm men kết lắng và đo độ trong của lớp dịch trong mỗi ống nghiệm.
5.1.6 Phương pháp xác định khả năng tạo hương [13]
Hương thơm cũng là một trong ba chỉ tiêu quan trọng để tuyển chọn chủng nấm men thích hợp cho lên men dịch thanh long.
Xác định khả năng tạo hương thơm của các chủng nấm men bằng giác quan như sau:
Cấy các chủng nấm men cần khảo sát vào thạch đĩa cĩ chứa mơi trường Hansen đặc (MT1) và vào ống nghiệm cĩ chứa mơi trường dịch thể (MT2). Nuơi ở nhiệt độ phịng trong 72 giờ. Sau đĩ đánh giá, so sánh khả năng tạo hương của các chủng bằng khứu giác với hai trường hợp nuơi cấy thạch đặc và nuơi cấy dịch thể.
5.1.7 Phương pháp xác định kháng sinh bằng phương pháp khuếch tán trên thạch [11] [26] [52]
* Nguyên tắc: dựa vào sự khuếch tán của chất ức chế trong dịch nuơi cấy vào mơi trường thạch, chổ nào cĩ chất ức chế khuếch tán nơi đĩ vi sinh vật kiểm định khơng mọc được và tạo thành vịng vơ khuẩn.
* Tiến hành:
9 MT10 cĩ chứa từng loại vi khuẩn kiểm định (Escherichia coli, Klebsiella, Serratia sp., Streptococcus. sp, Bacillus pimitilis và Salmonella typhimurium) được đổ vào các đĩa petri bằng nhau, mỗi đĩa 20ml.
9 Khoan lỗ thạch
9 Nhỏ 0,1ml dịch nuơi cấy vào lỗ thạch, giữ ở 40C trong 4-5 giờ
9 Chuyển sang nuơi ở tủ ấm với nhiệt độ thích hợp tùy từng loại vi khuẩn kiểm định. Sau 24 giờ kiểm tra vịng vơ khuẩn.
Hoạt tính kháng sinh được đánh giá bằng hiệu số D – d (mm) Với: D: đường kính vịng ức chế (mm)
5.1.8 Phương pháp xác định khả năng kháng các kháng sinh của dịch nuơi cấy bằng phương pháp dùng đĩa kháng sinh chuẩn [3]
Dùng que gạt cấy chủng nấm men trên các đĩa petri cĩ chứa mơi trường MT1, sau đĩ đặt các đĩa giấy cĩ tẩm chất kháng sinh lên mặt thạch. Để sau 24 giờ kiểm tra cĩ hay khơng vịng vơ khuẩn.
5.2 Các phương pháp hĩa lý
5.2.1 Phương pháp xác định hàm lượng nước [47]
Cân chính xác 1g dịch nghiên cứu, đem sấy khơ ở nhiệt độ 100-1050C đến khối lượng khơng đổi. Lấy khối lượng ban đầu trừ khối lượng sau khi sấy khơ từ đĩ ta tính được hàm lượng nước trong mẫu.
5.2.2 Phương pháp định lượng hàm lượng đường bằng phương pháp so màu trên máy quang phổ UV-1601 PC [14] [15] [43]
* Nguyên tắc: xác định hàm lượng đường trong mẫu dựa trên phản ứng màu đặc trưng bởi đường và chất hữu cơ với sự hiện diện của H2SO4 đậm đặc.
* Tiến hành:
Bước 1: Thiết lập đồ thị chuẩn và mối tương quan giữa hàm lượng glucose chuẩn với OD490
Chuẩn bị glucose chuẩn với các nồng độ sau:
Số thứ tự 1 2 3 4 5 6 7 Glucose (ml) 1 2 3 4 5 6 7 H2O (ml) 99 98 97 96 95 94 93 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
[C] mg/l 10 20 30 40 50 60 70 Ghi chú: [C]: nồng độ glucose
Tiến hành phản ứng so màu: dung dịch glucose chuẩn : phenol 5% : H2SO4 đậm đặc = 1 : 1 : 5, lắc nhẹ, đều, để lắng.
¾Bước 2: Xác định glucose trong dịch nghiên cứu Cân 1g dịch trái thanh long.
Dịch được chiết với cồn 900 nĩng 3 lần với tỷ lệ cồn : mẫu = 10 : 1. Tiếp tục như trên (2 lần) với cồn 800 nĩng.
Cơ cạn dịch lọc rồi pha lỗng với nước cất.
Cho phản ứng màu: dung dịch đường : phenol 5% : H2SO4 đậm đặc = 1 : 1 : 5 lắc nhẹ, đều, để lắng.
Đo OD490. Suy ra lượng đường cĩ trong dịch nghiên cứu dựa vào đồ thị chuẩn.
5.2.3 Phương pháp xác định hàm lượng chất khơ bằng chiết quang kế cầm tay [49]
Khi đi từ một mơi trường (khơng khí) vào một mơi trường khác (chất lỏng) tia sáng sẽ bị lệch đi (khúc xạ).
Nếu chất lỏng là một dung dịch chất hịa tan (dung dịch đường, muối,…) dựa trên độ lệch của tia sáng ta cĩ thể xác định được hàm lượng chất khơ.
5.2.4 Phương pháp xác định nồng độ rượu [15]
Chưng cất 100ml dịch lên men ở hệ thống chưng cất cồn, thu nhận 70-80ml dịch ngưng đọng, pha lỗng bằng nước cất đến 100ml. Đo độ cồn trong dịch ngưng đọng bằng cồn kế rồi quy về độ cồn chuẩn ở 150C.
5.2.5 Phương pháp xác định acid tổng số [63]
* Nguyên tắc: Xác định hàm lượng acid trong dung dịch nghiên cứu bằng dung dịch kiềm chuẩn, nhờ sự đổi màu của thuốc thử.
* Tiến hành:
Lấy 20ml mẫu nghiên cứu, thêm 30ml nước cất và 5 giọt chất chỉ thị
(chất chỉ thị gồm hỗn hợp: 0,2% metyl đỏ trong dung dịch rượu 700 và 0,1% xanh metylen trong dung dịch rượu 700 theo tỷ lệ 1 : 1)
Đem chuẩn độ bằng KOH 0,1N cho đến khi dung dịch chuyển từ màu tím sang màu xanh lá mạ.
Từ số ml KOH 0,1N đã sử dụng cĩ thể tính được hàm lượng acid tổng số cĩ trong dung dịch bằng biểu thức
V b a
X = . .1000 X: hàm lượng acid tổng số (g/l) a: lượng KOH đã chuẩn độ
b: lượng acid tương đương 1ml KOH 0,1N tính