Đây là phương pháp ni cấy dựa trên một bình ni cấy được thiết kế chuyên biệt nhằm mục đích nhân số lượng lớn tế bào, mơ hay cơ quan trong mơi trường lỏng có hệ thống làm thống khí.
1.1.4.4. Ứng dụng của kỹ thuật nhân giống in vitro
Nhân giống các loại cây cảnh là ứng dụng phổ biến nhất trong kỹ thuật nuôi cấy mô. Hiện nay tất cả lan thương mại đều sản xuất bằng cách này. Ngồi ra cịn có: Dương Xỉ, Cẩm Chướng, Cúc, Petunia,...(xem bảng 1.1).
Kỹ thuật nuôi cấy mô thực vật bậc cao để cải thiện cây trồng bao gồm những ứng dụng: nhân giống vơ tính với tốc độ nhanh, tạo cây trồng sạch bệnh và kháng bệnh, cảm ứng và tuyển lựa dòng đột biến, sản xuất cây đơn bội qua nuôi cấy túi phấn, lai xa qua môi trường ni cấy phơi và nỗn, tạo dịng lai xa soma và lai tế bào trần (protoplast), cố định nitrogen, cải thiện hiệu quả quang tổng hợp, bảo quản các nguồn gen.
Bảng 1.1. Các phương pháp nhân giống thực vật (Takayama, 1991)
nhân
giốnga nhân
giốnga
A B C D A B C D
Cây ăn quả Phalaenopsis x x x -
Malus pumila x x x - Miltonia x x - -
Pyrus communis x x - - Dendrobium x x - -
Prunus avium x x - -
Prunus persica x x - - Cây xanh
Vitis vinifera x x - - Eucalyptus x x - -
Citrus sp. x x - - Populus x x - -
Cây rau/củ Cây cảnh
Solanum tuberosum x x x x Ficus benjamina x x - -
Aspagagus officinalis x x x x Poinsettia x x - -
Fragaria ananassa x x x x Anthurium x x x x
Zingiber officinale x x x - Dieffenbachia x x x x
Amorphophalus x x x x Monstera x x - - Dioscorea x x x x Philodendron x x - - Colocasia x x x x Syndapsis x x - - Cucumis x x - - Caladium x x x x Lycopersicum esculentum x x Alocasia x x - - Ananas x x x -
Cây hoa Neoregelia x x - -
Lilium x x x x Doracaena x x - - Begonia x x x x Nandina x x - - Chrysanthemum x x x - Adiantum x x x - Saintpaulia x x x - Nephrolepis x x - - Gerbera x x - - Asplenium x x - - Dianthus x x x - Cyathea x x - - Geranium x x - - Nepenthes x x - - Rosa x x - - Spathiphyllum x x x x Rhododendron x x - - Hosta x x - - Gloxinia x x x - Ophiopogon x x - - Streptocarpus x x x -
Paeonia x x - - Cây mùa vụ
Allium x x - - Musa sp. x x - -
Colchicum x x - - Ananas comosus x x x -
Hyppeastrum x x x x Eraeis guineensis x x x -
Nerine x x x - Manihot esculenta x x - -
Lycoris x x - -
Narcissus x x - - Cây thuốc
Crocus x x - - Scopolia japonica x x x x
Freesia x x - - Atropa belladonna x x x x
Gladiolus x x x x Pinellia x x x x
Cattleyya x x - -
Cymbidium x x x -
a Phương pháp nhân giống: A: cây sạch bệnh được tạo ra bằng nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, B: nuôi cấy trên môi trường có agar, C: ni cấy lỏng lắc, D: ni cấy bằng bioreactor.
1.2. HỆ THỐNG BIOREACTOR TRONG NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT1.2.1. Giới thiệu chung 1.2.1. Giới thiệu chung
Tự động hóa sự phát sinh cơ quan trong bioreactor được đặt lên hàng đầu như là một phương pháp khả thi trong việc làm giảm chi phí của vi nhân giống thương mại (Takayama và Akita, 1994; Leathers et al., 1995; Paek et al., 2002). Nhân giống trên quy mô lớn thực vật qua nuôi cấy phơi, mơ và tế bào bằng bioreactor đang có nhiều triển vọng trong nhân giống cây trồng quy mô công nghiệp. Bioreactor sử dụng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật được cải tiến từ các loại bioreactor trong nuôi cấy tế bào vi sinh.
Việc sử dụng bioreactor cho nhân giống thực vật được báo cáo đầu tiên vào năm 1981 với nghiên cứu của tác giả Takayama trên đối tượng là cây Begonia (cây thu Hải Đường). Về sau, hệ thống này cịn được ứng dụng có hiệu quả trên nhiều lồi thực vật khác (Takayama, 1991).
Sử dụng một bioreactor cỡ nhỏ (từ 4 - 10 lít) trong khoảng 1 - 2 tháng có thể tạo ra đến 4.000 - 20.000 cây con. Điều này cho thấy khả năng và triển vọng to
lớn của việc áp dụng hệ thống bioreactor trong vi nhân giống thương mại đồng thời mở ra một hướng mới trong sản xuất các sản phẩm có hoạt tính sinh học có nguồn gốc thực vật (Takayama, 1991).
Mục đích của ni cấy bioreactor là tăng nhanh số lượng lớn các chồi đồng nhất và đồng thời giúp giảm chi phí trong nhân giống thực vật (Nhut và cộng sự, 2004).
Bioreactor được mơ tả là một bình phản ứng có những tính chất sau: ni cấy trong điều kiện vô trùng, nuôi cấy trong môi trường lỏng, số lượng mẫu cấy nhiều, có khả năng tự động hóa, vi tính hóa thơng qua vi điều khiển các yếu tố mơi trường như mức độ khuấy trộn, thống khí, nhiệt độ, oxy hịa tan, pH,…
Nuôi cấy bằng bioreactor là một trong những phương pháp đầy hứa hẹn cho nhân giống với số lượng lớn tế bào, phôi soma hay các đơn vị phát sinh cơ quan (củ, hành, đốt, củ bi hay cụm chồi), trong đó đã có một số báo cáo về nhân giống các loại cây hoa cảnh và cây dược liệu bằng bioreactor.
Tuy nhiên, sự mâu thuẫn trong việc tối ưu các loại bioreactor cũng như các thông số ni cấy cũng được nêu lên. Ngun nhân chính là do sự khác nhau về lồi, do đó cần phải quan sát cẩn thận từng trường hợp cụ thể. Khi chuẩn bị ni cấy trên một đối tượng nào đó, thơng thường bắt đầu với hệ thống bioreactor nhỏ để tối ưu hóa các điều kiện ni cấy, sau đó việc ni cấy trong các bioreactor (500 – 1000 lít) quy mơ lớn dễ dàng thực hiện hơn.
1.2.2. Cấu trúc và phân loại bioreactor1.2.2.1. Cấu trúc bioreactor 1.2.2.1. Cấu trúc bioreactor
Có nhiều kiểu bioreactor khác nhau. Chúng được phân biệt theo dạng: phương pháp khuấy, theo kiểu bầu chứa, theo kiểu sục khí, theo chế độ chiếu sáng (Takayama, 1991). Xét về cấu tạo chung thì bioreactor ni cấy mơ thực vật cũng giống bioreactor ni cấy tế bào động vật hay vi sinh vật.
Hình 1.1. Mơ hình bioreactor được nối với cánh khuấy có mơ-tơ.
Vào khoảng cuối năm 1950, các nhà khoa học đã thiết kế nhiều kiểu bồn lên men (fermenter). Các kiểu đơn giản được thiết kế vào năm 1959, bao gồm bình 20 lít. Bình này có một nút cao su lớn và 4 ống nhỏ (ống cho khí vào, ống khí ra, ống mơi trường vào, ống lấy mẫu ra). Hệ thống chai quay được thiết kế năm 1964.
Hiện nay, tuy kích thước bioreactor ni cấy tế bào thực vật không ngừng tăng lên nhưng cấu trúc của chúng vẫn tương tự các bồn lên men vi sinh vật.
Bioreactor là một mơ hình ni cấy phù hợp nhất cho nuôi cấy mô thực vật trong việc sản xuất nhanh một số lượng lớn cây con trong một mẻ nuôi cấy. Các loại bioreactor được sử dụng phổ biến là loại có thể tích 2 - 20 lít vì chúng có một số thuận lợi sau:
- Dễ dàng vận hành - Có thể vơ trùng dễ dàng - Giá thành thấp