THỜI GIAN, đỊA đIỂM, VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.4.2 Phương pháp nghiên cứu ựặc ựiểm sinh thái học của nhện gié
2.4.2.1 Phương pháp ựiều tra diễn biến mật ựộ và mức ựộ gây hại của nhện gié
+ điều tra diễn biến mật ựộ và mức ựộ gây hại của nhện gié theo vụ lúa: Mỗi vụ lúa trong năm ựiều tra ựại diện ở trà chắnh vụ (xuân chắnh vụ 2010, 2011 và mùa chắnh vụ 2009, 2010). Ở mỗi vụ ựiều tra trên một số giống lúa cấy phổ biến: Khang dân 18, Q5, Bắc thơm số 7, TH3-3, Hương thơm số 1.
+ điều tra diễn biến mật ựộ và mức ựộ gây hại của nhện gié trên các chân ựất (chân vàn cao, chân vàn và chân trũng), cấy cùng giống Khang dân
18, vụ mùa chắnh vụ 2010 tại Cẩm Sơn, huyện Cẩm Giàng, Hải Dương.
+ Diễn biến mật ựộ và mức ựộ gây hại của nhện gié ở các mức phân ựạm khác nhau: Thắ nghiệm ựược bố trắ ở vụ mùa chắnh vụ 2010, tại Cẩm Sơn, huyện Cẩm Giàng, Hải Dương. Mỗi công thức diện tắch 300 m2, không nhắc lại. Giống lúa Khang dân 18.
Công thức 1: 100 kgN/ha. Công thức 2: 120 kgN/ha. Công thức 3: 150 kgN/ha).
Ở các ruộng ựại diện cho mỗi yếu tố (thời vụ, giống lúa, chân ựất, mức bón ựạm) tiến hành ựiều tra theo Tiêu chuẩn ngành 10TCN 982 Ờ 2006 (Bộ NN&PTNT) [1] và QCVN01-38:2010/BNNPTNT ngày 12/10/2010 (Bộ NN&PTNT) [2].
- điều tra ựịnh kỳ 7 ngày một lần, từ sau lúa cấy/sạ ựến khi thu hoạch. - điều tra 10 ựiểm ngẫu nhiên theo ựường chéo, ựiểm cách bờ ắt nhất 2m.
- Mỗi ựiểm lấy 10 khóm, mỗi khóm lấy 1 dảnh, dùng kéo cắt sát gốc dảnh lúa và cho 10 dảnh của 1 ựiểm vào 1 túi nilon có ựánh số, ựem về phịng thắ nghiệm quan sát và soi trên kắnh lúp, ựộ phóng ựại 40x.
Chỉ tiêu ựiều tra
- Mật ựộ nhện gié/dảnh, phân cấp hại, tỷ lệ hại (%) và chỉ số hại (%). Phân cấp hại của dảnh lúa (trước trỗ) và của bông lúa (sau trỗ). Phân cấp hại theo 9 cấp
Trước trỗ:
+ Cấp 1: < 1/6 diện tắch bẹ lá có vết hại. + Cấp 3: >1/6 - 1/3 diện tắch bẹ lá có vết hại.
+ Cấp 5: >1/3 - 1/2 diện tắch bẹ lá có vết hại. + Cấp 7: > 1/2 - 3/4 diện tắch bẹ lá có vết hại.
+ Cấp 9: > 3/4 diện tắch bẹ lá và thân có vết hại, thân cây bị thâm ựen.
Trên bông: + Cấp 1: < 1% hạt bị hại + Cấp 3: 1 - 5% hạt bị hại + Cấp 5: > 5 - 25% hạt bị hại + Cấp 7: > 25 - 50% hạt bị hại + Cấp 9: > 50 % hạt bị hại Công thức tắnh Tổng số dảnh bị hại - Tỷ lệ hại (%) = x 100 Tổng số dảnh ựiều tra Σ[(N1 x 1) + ... + (Nn x n)] - Chỉ số hại (%) = x 100 N x K Trong ựó: N1: là số dảnh bị hại ở cấp 1 Nn: là số dảnh bị hại ở cấp n N: là tổng số dảnh ựiều tra
K: là cấp hại cao nhất của thang phân cấp (= 9).
2.4.2.2 Phương pháp xác ựịnh ký chủ của nhện gié
Phương pháp ựiều tra tự do: thu thập các loài cỏ dại phân bố trong ruộng lúa, bờ ruộng cho vào túi nilon ựưa về phòng thắ nghiệm soi dưới kắnh lúp 40x, xác ựịnh sự có mặt các pha phát dục của nhện gié.
đồng thời tiến hành cấy các lồi cỏ ựã ựiều tra vào xơ nhựa, mỗi lồi cấy 3 xơ, sau ựó lây nhiễm nhện gié lên các loài cỏ dại, sau lây nhiễm nếu quan sát nhện gié tồn tại và hoàn thành ựược vịng ựời (có ựầy ựủ các pha
phát dục) trên lồi cỏ dại thì ta xác ựịnh lồi cỏ dại là ký chủ của nhện gié.
2.4.2.3 Phương pháp xác ựịnh khả năng phát tán, lây lan của nhện gié
* Khả năng lây lan qua vết thương cơ học
đánh giá khả năng xâm nhập lây lan của nhện gié qua vết thương cơ học ựược tiến hành trên giống Khang dân 18, với 2 thắ nghiệm.
Thắ nghiệm 1: gồm 3 công thức (CT) CT1: Cắt 1/3 lá từ phắa ựầu lá
CT2: Gập gãy lá lúa ở vị trắ cách gốc bẹ lá 1/3 chiều dài lá CT3: ựối chứng (ựể lá lúa phát triển bình thường).
Theo dõi thắ nghiệm và thu kết quả sau 10, 15 và 20 ngày. Thắ nghiệm 2: gồm 4 công thức (CT)
CT1: Cắt 1/3 lá từ phắa ựầu lá (cắt ngang lá) CT2: Cắt 1/2 lá từ phắa ựầu lá
CT3: Cắt 2/3 lá từ phắa ựầu lá CT4: đối chứng không cắt
Ở công thức 1, 2 và 3 tiến hành theo dõi sau cắt lá 1, 2, 3, 4, 5, 6 và 7 ngày, công thức ựối chứng theo dõi kết quả vào ngày cắt lá cho tới sau 7 ngày.
Chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ hại (%), chỉ số hại (%) và mật ựộ nhện/lá. * Khả năng phát tán qua dòng nước của nhện gié
Thắ nghiệm trên giống Khang dân 18 ựược cấy trong khay thắ nghiệm, kắch thước 1 x 1 m (lúa ựược cấy ở 2 ựầu của khay thắ nghiệm với 16 khóm lúa, khoảng cách giữa các khóm lúa là 10 cm, giữa 2 ựầu lúa cấy ựể một khoảng trống là 60 cm, mực nước trong khay giữ ở 10 cm, xung quanh khay lúa có ựắp bờ, nhện gié ựược lây 30 cặp ựực cái/khóm lúa), với 3 lần nhắc lại với 4 công thức sau:
CT1: 1 ựầu lây nhện, 1 ựầu khơng lây nhện, giữa có nước.
lây nhện sang ựầu không lây nhện.
CT3: hai ựầu khơng lây nhện, khơng có dịng nước chảy.
CT4: 1 ựầu lây nhện, 1 ựầu không lây nhện, giữa khơng có nước.
Dịng nước trong khay lúa do máy bơm tạo ra. Thời gian dòng nước chảy sau khi lây nhện là 10 ngày, tốc ựộ dòng nước 20 cm/s. Tất cả các khay ựược ựặt trong nhà lưới ựể ựảm bảo khơng có tác nhân gây hại khác.
Chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ hại (%), chỉ số hại (%) của nhện gié sau lây nhện 20, 30 và 40 ngày.
* Khả năng phát tán qua gió của nhện gié trên ựồng ruộng
Xác ựịnh khả năng phát tán của nhện gié qua gió ựược thực hiện bằng cách: cấy lúa (giống Khang dân 18) vào khay thắ nghiệm (1m x 1m). Lúa ựược cấy với khoảng cách 25 khóm/khay, khoảng cách giữa các khóm là 20 cm, lây nhện vào các khay ở cùng một ựầu.
đặt quạt gió cách khay lúa có lây nhện là 2 m. Thời gian quạt gió sau khi lây nhện là 10 ngày, tốc ựộ quạt gió 70 cm/s.
CT1: khay khơng có nhện cách khay có nhện 0,5 m. CT2: khay khơng có nhện cách khay có nhện 1,0 m. CT3: khay khơng có nhện cách khay có nhện 1,5 m. Các khay lúa ựặt trong nhà lưới.
Chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ hại (%), chỉ số hại (%) của nhện gié sau lây nhện 20, 30 và 40 ngày.
2.4.2.4 Phương pháp xác ựịnh mối liên quan giữa ựặc ựiểm giải phẫu, hàm lượng silic và sự xâm nhiễm gây hại của nhện gié
Thắ nghiệm ựược tiến hành trên 12 giống lúa: Khang dân 18, TBR1, Q5, Bắc thơm số 7, Hương cốm, Nam ưu 714, BC15, VL24, DL6, Nam ưu 614, Khâm dục, Tám mới.
- Bố trắ thắ nghiệm, cấy lúa:
+ Mỗi ơ thắ nghiệm có kắch thước là 1m2 (1m x 1m), ựóng cọc, căng dây theo kắch thước ựể làm khung chia ô.
+ Cấy 12 giống lúa trên cùng 1 ruộng thắ nghiệm, mỗi giống cấy trong 1 ơ với 40 khóm lúa, mỗi khóm cấy 2 dảnh (khoảng cách là 18 x 14 cm). Giữa các giống cấy cách nhau 50 cm.
+ Sau khi cấy xong, ựóng cọc, dùng nilon quây xung quanh, phắa trên ựược bao bọc bằng vải màn tuyn ựược ghim ựắnh với nilon.
Hình 2.3. Bố trắ thắ nghiệm mối liên quan giữa ựặc ựiểm giải phẫu, hàm lượng Si và sự xâm nhiễm gây hại của nhện gié
Nguồn: Dương Tiến Viện, 2010.
+ Sau cấy 15 ngày tiến hành lây nhện: Lấy các ống thân của cây lúa giai ựoạn sau trỗ, cắt thành ựoạn 3 - 4 cm, dùng bút lông 01 sợi chuyển 20 nhện cái di ựộng chậm vào mỗi ống thân, cuốn nilon ở ựầu ống thân, ựem gài vào dảnh lúa ở vị trắ nách lá lúa (trước khi gài mở nilon ở ựầu ống thân ra). Mỗi khóm lây 2 dảnh là các dảnh to nhất của khóm.
Tiến hành theo dõi tại 4 giai ựoạn phát triển của cây lúa: giai ựoạn ựẻ nhánh (sau cấy 30 ngày), làm ựòng, trước trỗ (sau cấy 45 ngày), giai ựoạn trỗ (sau cấy 60 ngày) và giai ựoạn chắn sữa (sau cấy 75 ngày). Mỗi giống thu 10
dảnh (theo 5 ựiểm chéo góc, mỗi ựiểm 2 khóm, mỗi khóm 1 dảnh), cho mỗi giống vào một túi lấy mẫu ựem về phòng soi nhện.
- Phương pháp làm tiêu bản giải phẫu các giống lúa
Giai ựoạn trỗ, tiến hành lấy mẫu, mỗi giống lấy 30 mẫu. đưa các mẫu ựã thu ựược vào dung dịch cồn 50% ựể cố ựịnh tạm thời, sau ựó thay dung dịch cồn 50% cố ựịnh tạm thời bằng dung dịch FAA ựể giữ mẫu trong thời gian dài và cố ựịnh tồn bộ các tổ chức mơ. Trong tuần ựầu tiên liên tục kiểm tra chất lượng dung dịch cố ựịnh, nếu dung dịch ngả màu nâu ựen ngay lập tức rửa sạch mẫu và chuyển sang dung dịch mới. đối với mẫu lá lúa và bẹ lá lúa chỉ cần chuyển 1 lần vì lá, bẹ lúa khơ, ắt dịch chứa trong các khoang mô nên chất lượng dung dịch cố ựịnh ựược ựảm bảo.
Các mẫu ựều ựược cắt ngang những lát thật mỏng trên máy cắt bằng tay (mỗi số hiệu ựược cắt riêng biệt ựể trong từng ựĩa ựồng hồ ựể ựảm bảo không lẫn mẫu, cắt mẫu lần lượt theo các số hiệu ựã ựược ựánh số). Mẫu cắt ựược lấy từ các phần khác nhau của bẹ, của phiến lá ựể lấy giá trị trung bình. Các vi phẫu sau khi ựược cắt mỏng sẽ ựem nhuộm mẫu theo từng bước và cố ựịnh mẫu.
Ngâm mẫu vừa cắt vào nước Javen 15-20 phút, rửa sạch mẫu bằng nước cất.
Ngâm mẫu vào dung dịch axit axetic 5% trong 5 phút, (ựể trung hồ hết Javen cịn sót lại) tránh làm mất màu mẫu nhuộm sau này. Rửa sạch mẫu bằng nước cất.
Nhuộm mẫu lần 1 trong dung dịch carmin phèn chua từ 20 ựến 30 phút (ựối với những mẫu ựem cố ựịnh thì nhuộm từ 3 ựến 4 giờ trong ựiều kiện nhiệt ựộ 4-5oC). Rửa sạch mẫu bằng nước cất.
Nhuộm mẫu lần 2 trong dung dịch xanhmethylen 1%0 1% từ 30Ợ ựến 1 phút (ựối với những mẫu ựem cố ựịnh thì nhuộm trong vịng 30 phút ựến 1 giờ).
Lấy mẫu rửa sạch và lên kắnh quan sát (Nguyễn Khoa Lân, 1999) [17]. Chọn những mẫu ựẹp, sắc nét lên kắnh và tiến hành chụp ảnh.
Chỉ tiêu chụp: Hình thái của gân, sự phân bố của các khoang chứa khắ, lột tả bó dẫn, mơ cứng và các tổ chức bị tổ thương do sự xâm nhập của nhện
Phương pháp ựo: Sử dụng trắc vi thị kắnh ựo kắch thước khoang khắ, chiều dày tầng mô cứng và ựộ dày tầng cutin ở ựộ phóng ựại 40x. đơn vị tắnh là ộm.
- Phương pháp xác ựịnh hàm lượng Silic của các giống lúa
Cắt sát gốc 12 giống lúa ở giai ựoạn chắn hồn tồn, mỗi giống cắt 10 khóm ựem về ựánh dấu, cắt bỏ phần bông lúa, phơi khơ 5 nắng. Sau ựó ựem sấy ở tủ sấy (nhiệt ựộ 80oC trong 2 giờ ựến khối lượng không ựổi). Cân mẫu ựể tắnh khối lượng khô, ựốt lấy tro, cân khối lượng tro. Phân tắch hàm lượng Silic trong mẫu tro của các giống lúa tại phịng thắ nghiệm bộ mơn Hố phân tắch, khoa đất và Môi trường, Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội.
Phương pháp phân tắch hàm lượng Silic trong mẫu tro: Nung chảy tro thực vật với Na2CO3, tách Silic dưới dạng axit Silixic bằng HClO4 nồng ựộ 2 M. Rửa kết tủa bằng dung dịch HCl nồng ựộ 2M. Sau ựó sấy khơ kết tủa ở nhiệt ựộ 110oC và tiến hành cân, xác ựịnh hàm lượng silic (Viện Nơng hóa Thổ nhưỡng, 1998) [27].
2.4.2.5 Phương pháp ựiều tra, nghiên cứu thiên ựịch của nhện gié
Xác ựịnh thiên ựịch của nhện gié ựược ựiều tra theo phương pháp tự do. Các mẫu vật thiên ựịch của nhện gié ựược miêu tả và cất giữ trong lọ có chứa cồn 70o, ghi nhãn thời gian và ựịa ựiểm thu mẫu.
Phương pháp ựịnh loại:
Các mẫu nhện nhỏ bắt mồi ựược ựịnh loại dựa theo phương pháp thường quy ựang ựược áp dụng (Henderson, 2001 [55], (Jeppson et al., 1975) [63],
ựặc ựiểm cấu tạo của nhện dựa theo mơ tả và hình vẽ mà các tác giả ựã nêu. Chỉ tiêu theo dõi:
+ độ bắt gặp các ựối tượng ựiều tra tại ựiểm ựiều tra Ad(%):
đánh giá mức ựộ phổ biến theo không gian của ựối tượng ựiều tra tại vùng nghiên cứu. độ bắt gặp càng lớn chứng tỏ ựối tượng ựiều tra phân bố càng rộng, có mặt ở nhiều nơi
Ad(%) =
Nni ni
x 100
Trong ựó: ni là số mẫu ựiều tra bắt gặp lồi i
N là tổng số mẫu của một kỳ ựiều tra tại nhiều ựiểm khác nhau. đánh giá kết quả: -: Rất ắt phổ biến (mức ựộ bắt gặp < 25%)
+: Ít phổ biến (mức ựộ bắt gặp 25- 50%) ++: Trung bình (mức ựộ bắt gặp 51- 75%) +++: Nhiều (mức ựộ bắt gặp >75%) + Tần suất xuất hiện của các ựối tượng ựiều tra Af (%):
Phản ánh mức ựộ xuất hiện thường xuyên của các loài trên ựồng ruộng theo thời gian tại một ựịa ựiểm nghiên cứu. Tần xuất xuất hiện càng lớn thì ựối tượng có mặt khá thường xuyên, dễ bắt gặp ở các thời kỳ ựiều tra.
Af (%) =
Tti ti
x 100
Trong ựó: ti là số lần ựiều tra bắt gặp lồi i
T là tổng số lần ựiều tra (ắt nhất là 10 lần) đánh giá kết quả:
- : Rất ắt phổ biến (Tần suất xuất hiện < 25%) + : Ít phổ biến (Tần suất xuất hiện 25- 50%) ++ : Phổ biến (Tần suất xuất hiện 51- 75%) +++ : Rất phổ biến (Tần suất xuất hiện >75%) Nghiên cứu về thiên ựịch của nhện gié:
ựó là lồi Lasioseius sp.
- đặc ựiểm hình thái của nhện nhỏ bắt mồi Lasioseius sp. * Chuẩn bị nhện bắt mồi thắ nghiệm:
Chuyển 80 nhện bắt mồi cái trưởng thành vào lồng kắn với ựường kắnh là 1cm. Dùng bút lông quét nhện gié S. spinki với số lượng lớn vào làm thức ăn cho NBM (thức ăn dư thừa), cho một lớp bông mỏng lên trên bề mặt ựể NBM ựẻ trứng lên trên các sợi bông, sau 24 giờ lấy lớp bông ra khỏi lồng rồi dùng kéo và dao lam thu trứng NBM trên bông. Chuyển trứng NBM ra các khay có sẵn nhện gié. Ghi rõ ngày lấy trứng, trung bình khoảng 40 trứng NBM/khay.
Nuôi nhện bắt mồi với thức ăn là nhện gié, xác ựịnh màu sắc, kắch thước các pha phát dục của nhện bắt mồi (n = 30) (Brich, 1948) [38], (Nguyễn Văn đĩnh, Nguyễn Thị Kim Oanh (2005) [10].
`
Hình 2.4. Lồng ni nhện bắt mồi Hình 2.5. Hộp nhựa chứa K2SO4 bão hịa ựể ni NBM
Nguồn: Dương Tiến Viện, 2010.
- Xác ựịnh sức ăn của nhện bắt mồi:
Nhện bắt mồi không ựược cho ăn 24 giờ trước khi làm thắ nghiệm. Các pha phát dục của NBM thắ nghiệm:
Nhện non tuổi 1 (1 ngày tuổi sau nở). Nhện non tuổi 2 (1 ngày tuổi)
Nhện non tuổi 3 (1 ngày tuổi)
Nhện trưởng thành ựực và cái ựược lấy từ trong quần thể nhện bắt mồi ựa ựược nhân ni.
Chuẩn bị lồng ni (hình 2.4) bao gồm:
Lớp 1: Lam kắnh, kắch thước 4cm x 2cm; Lớp 2: Giấy thấm (ựược làm ẩm); Lớp 3: Bẹ lá ựòng; Lớp 4: Tấm mica 4cm x 2cm, ựường kắnh lỗ thủng 1cm, chiều sâu 3 mm; Lớp 5: Lam kắnh: 4cm x 2cm.
Lồng kắn ựược cố ựịnh bằng 2 kẹp giấy ở 2 ựầu.
Dùng bút lông chuyển nhẹ nhàng trứng từ nguồn nhện gié với số lượng 50 trứng/lồng ni. Q trình ựược quan sát và thực hiện dưới kắnh lúp.
Chuyển NBM ở từng pha phát dục vào từng lồng nuôi.
đặt các lồng nuôi vào giá ựỡ trong hộp nhựa (40 x 30 x 20 cm) có chứa K2SO4 bão hịa, cho vào tủ ựịnh ơn, nhiệt ựộ 30oC, ẩm ựộ 96%.
Sau 24 giờ, kiểm tra số trứng còn lại trong từng lồng. Số lần nhắc lại n=30.
- Xác ựịnh sự lựa chọn thức ăn của nhện bắt mồi: Chuẩn bị lồng ni như hình 2.4.
Chuyển các pha phát dục của nhện gié với số lượng (trứng: 30; nhện non di ựộng: 30; nhện non không di ựộng: 30; trưởng thành ựực và cái: 20) vào từng lồng nuôi. Chuyển nhện cái bắt mồi cho vào từng lồng nuôi.
đặt các lồng nuôi vào giá ựỡ trong hộp nhựa (40 x 30 x 20 cm) có chứa K2SO4 bão hịa, cho vào tủ ựịnh ôn, nhiệt ựộ 30oC, ẩm ựộ 96%.
Sau 24 giờ, kiểm tra số lượng các pha phát dục của nhện gié còn lại trong lồng nuôi.