Hiện nay, các phòng thí nghiệm đang sử dụng các phương pháp sắc ký
để phát hiện nấm Aspergillus sinh độc tố Aflatoxin như: sắc ký lớp mỏng
(TLC), sắc ký lớp mỏng cao áp (HPLC) [38]. Ưu điểm của phương pháp này là có thể định lượng chính xác hàm lượng Aflatoxin nhiễm trong mẫu thí nghiệm. Tuy nhiên, phương pháp này lại có nhược điểm là cần phòng thí nghiệm được trang bị các máy chuyên dụng đắt tiền.
* Phương pháp sắc ký lớp mỏng (Thin layer chromatography-TLC)
Phương pháp sắc ký lớp mỏng được sử dụng rộng rãi để xác định, định lượng Aflatoxin lần đầu tiên vào những năm 1960 (Coomes và cs., 1964, 1965). Thủ tục phân tích sử dụng các bản được tráng bởi Silica gel. Dung môi sử dụng cho dung dịch chạy bản mỏng là Chloroform: methanol và Chloroform: axeton. Việc thêm nước vào hệ thống dung môi sẽ làm tăng khả năng hòa tan Aflatoxin. Hệ dung môi gồm: nước: axeton: chloroform (1,5: 12: 88) được đánh giá là có khả năng hòa tan Aflatoxin tốt nhất. Các bản mỏng đã được chảy qua các dung môi chạy, được đưa vào chiếu bởi đèn tử ngoại (UV) 365nm. Các vết mẫu phân tích có màu huỳnh quang xanh da trời hay xanh lá cây và có độ dài Rt được so sánh với các vết của Aflatoxin tiêu chuẩn. Nhược điểm của phương pháp này là phụ thuộc vào người phân tích. Khi so sánh giữa mẫu và các vết của độc tố chuẩn có thể có sự sai lệch kết quả tới 20 – 30% [6, 38].
* Phương pháp đo mật độ huỳnh quang trên máy fluorodensitometer
Fluorodensitometer có nhiều tiến bộ hơn, chính xác hơn so với nhìn bằng mắt thường (Dons, 1968). Tuy nhiên, ở nhiều phòng thí nghiệm hiện đại vẫn sử dụng phương pháp nhìn để so sánh trực tiếp các vết trên bản mỏng vì dễ
hơn nhiều khi phải qua máy densitometer [6]. Khẳng định sự có mặt của Aflatoxin của phương pháp này: một số chất được tách ra từ mẫu đôi khi dễ nhẫm lẫn với Aflatoxin, dẫn đến sự khẳng định sai lệch. Phương pháp khẳng định sự có mặt của Aflatoxin trực tiếp thực hiện trên các bản sắc ký. Dựa vào sự biến đổi của Aflatoxin thành các đồng phân có mầu huỳnh quang khác so với huỳnh quang ban đầu, cả Aflatoxin chuẩn và Aflatoxin có trong mẫu phân tích đều chuyển sang có cùng một đồng phân. Thử nghiệm khẳng định sự có mặt của Aflatoxin trong mẫu phân tích được phát hiện bởi Przybylski (1975) và Verhulsdonk (1977) và được hội phân tích hóa học Hoa Kỳ (A.O.A.C) công nhận. Aflatoxin B1 được axit hóa để trở thành đồng phân Aflatoxin B2. Đồng phân này có màu huỳnh quang màu xanh và có độ dài Rf thấp hơn so với độ dài của Rf của Aflatoxin B1. Theo phương pháp của Przybylski, Aflatoxin B1 được chuyển thành Aflatoxin B2a nhờ axit trifloaxetic (TFA) phun trực tiếp lên các bản mỏng. Axit sulfuric 50% cũng được sử dụng để phun trực tiếp lên các bản mỏng trước khi chạy trong các dung môi chạy. Axit
sulfuric làm thay đổi màu huỳnh quang xanh da trời của Aflatoxin B1 thành
màu vàng. Thử nghiệm này nhằm khẳng định sự không có mặt của Aflatoxin nếu vết nghi ngờ không chuyển thành màu vàng [6].
* Sắc ký lớp mỏng hiệu suất cao (High performance thin layer chromatography – HPTLC)
Do những khiếm khuyết trong phương pháp sắc ký lớp mỏng đơn thuần ở các khâu như chiết tách mẫu phân tích, chạy mẫu trong dung môi, phương pháp HPTLC có tính thuyết phục cao hơn ở 3 khía cạnh sau: Đưa mẫu lên bản mỏng một cách tự động; cải thiện sự đồng nhất cả lớp hấp thụ; chạy bản mỏng trong dung môi có kiểm soát.
Sử dụng kỹ thuật HPTLC làm tăng tính thuyết phục của phương pháp TLC như một phương pháp định lượng Aflatoxin có hiệu quả nhất.
* Phương pháp sắc ký lỏng cao áp (High performance liquid chromatography – HPLC)
Hệ thống phân tích Aflatoxin tự động HPLC là hệ thống phân tích đắt tiền, chọn lọc, dùng xác định định lượng Aflatoxin. Phương pháp HPLC sử dụng cả hai pha: pha bình thường và pha phản. Hệ thống này dựa trên sự hấp thu tia tím (UV) và xác định cường độ huỳnh quang. Trong pha bình thường, pha tĩnh là rắn, phân cực hơn pha động. Trong pha phản, pha bình thường là pha phản pha, pha tĩnh là lỏng và ít phân cực hơn pha động. Trong HPLC, pha phản được sử dụng để tách Aflatoxin nhiều hơn pha bình thường.