3. ỨNG DỤNG CỦA MONASCUS
3.3.3.3.Lựa chọn tỷ lệ tách chiết
Tiến hành chiết sinh khối lên men chìm bằng dung môi Cồn với nồng độ khác nhau: Cồn 60oC, 650C, 700C, 750C, Cồn tuyệt đối. Tiến hành chiết lặp lại 1, 2, 3 lần. Chiết động trong máy lắc 150v/ph, nhiệt độ 300C trong 30phút.
- Chiết lần 1:
Cân 1gam sinh khối + 20ml Cồn 700C
Đem mẫu trên vào máy lắc 150 vòng/phút, nhiệt độ 300C trong 30phút. - Chiết lần 2:
Thu hồi dịch chiết lần 1 bổ sung thêm 20ml dung môi ứng với từng mẫu nêu trên.Cho vào máy lắc 150 vòng/phút, nhiệt độ 300C trong 30phút.
- Chiết lần 3:
Thu hồi dịch chiết lần 2 bổ sung thêm 20ml dung môi ứng với từng mẫu nêu trên. Cho vào máy lắc 150v/ph, nhiệt độ 300C trong 30phút.
- Chiết lần 4:
Thu hồi dịch chiết lần 3 bổ sung thêm 20ml dung môi ứng với từng mẫu nêu trên. Cho vào máy lắc 150v/ph, nhiệt độ 300C trong 30phút.Ta thấy dịch chiết thu được ở lần 4 không có mầu.
Thu hồi dịch chiết sau 3 lần đầu sau đó đem ly tâm 6000 vòng/phút, nhiệt độ 100C. Lấy dịch đem pha loãng rồi đo màu ở các bước sóng: 370nm, 400nm, 500nm. Kết quả thể hiện ở bảng 11.
Bảng 11: Ảnh hưởng của tỷ lệ chiết đến sự tổng hợp chất màu và Monacolin của M. purpureus 5085 Số lần tách chiết Tỷ lệ dung môi
Cường độ màu / gam sinh khối ướt
370 nm 400 nm
Lần 1 1:20 410.5 490.1
Lần 2 1:20 148.3 250.5
Lần 3 1:20 55.7 35.2
Lần 4 1:20 Không mầu Không mầu
* Nhận xét:
- Sau 4 lần tách chiết ta thấy mầu dịch chiết sau mỗi lần giảm đi 1 cách
rõ rệt. Dịch biến đổi từ mầu đỏ đậm đến đỏ nhạt và cuối cùng là không mầu. Do vậy ta dừng lại ở lần chiết thứ 3 mà thôi. Sau 3 lần chiết ở nhiệt độ 300C, lắc 150v/ph, lượng mầu trong sinh khối nấm M. purpureus 5085 đã được trích ly hoàn toàn.
- Như vậy cùng 1 tỷ lệ dung môi, số lần trích ly tăng lên sẽ làm giảm khả năng tổng hợp sắc tố, trích ly lần đầu mầu đậm nhất cho cường độ mầu vàng, da cam cao nhất như bảng trên (tại bước sóng 370nm cường độ mầu là 410.5, bước sóng 400nm là 490.1).
Kiểm tra sự tạo thành Monacolin của M. purpureus 5085.
Hình 7: Kết quả chạy TLC
Mẫu 1: Sinh khối lên men chìm trích ly bằng cồn Mẫu 2: Monacolin chuẩn
Mẫu 3: Sinh khối lên men bề mặt trích ly bằng cồn
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
Kết luận:
Từ những kết quả nghiên cứu ở trên tôi rút ra các kết luận chính sau:
1. Sự phát triển của hệ sợi, bào tử chủng Monascus purpureus 5085
Hình thái sợi quan sát dưới kính hiển vi có hệ sợi dài, hình thái khuẩn ty không có vách ngăn, thể quả chai tròn mọc trên cuống. Chất màu hình thành trong hệ sợi có màu đỏ.
2. Nghiên cứu sự phát triển của chủng Monascus trên môi trường khác nhau
- Lên men bề mặt: Khi nuôi cấy bề mặt trên cơ chất gạo tẻ hấp chín,
Monascus purpureus 5085 tổng hợp chất màu tạo khối (gạo lên men) từ màu trắng đến đỏ sẫm sau 8 ngày ở 30oC.
- Lên men chìm: Dịch lên men chuyển từ mầu màu trắng đục tới màu đỏ (màu dâu chín). Thời gian lên men thích hợp nhất là 5 ngày, chế độ lắc 250 vòng/ phút ở 300C.
3. Nghiên cứu nâng cao khả năng tổng hợp chất màu và Monacolin của chủng Monascus purpureus 5085 khi nuôi cấy theo phương pháp lên men chìm
* Lựa chọn thành phần môi trường nuôi cấy thích hợp
- Lựa chọn được thành phần môi trường lên men thích hợp cho chủng
hàm lượng 6.5g/l. Sau khi lên men chìm với môi trường đã lựa chọn như trên ta thấy khả năng tổng hợp sắc tố mầu vàng, da cam là tốt nhất (tại bước sóng 370nm cường độ mầu là 410.5, bước sóng 400nm là 490.1).
* Lựa chọn điều kiện nuôi cấy tổng hợp chất màu từ nấm mốc M. purpureus 5085
- Môi trường lên men thích hợp nhất cho chủng phát triển là pH = 5.0. Khả năng tổng hợp chất mầu ở môi trường này tốt.
* Điều kiện tách chiết chất màu
- Sau khi tiến hành lên men và thu được sinh khối chúng tôi đã tiến hành thí nghiệm: chọn cồn 700C là dung môi tách chiết thích hợp nhất, tách chiết được lượng mầu nhanh và nhiều nhất với tỷ lệ chiết : 1:20ml, chiết động chế
độ lắc 250 vòng/ phút ở 300C và chỉ nên dừng lại ở 3 lần tách chiết.
Đề nghị:
Đề tài khóa luận là một phần của đề tài khoa học cấp Nhà nước, có ứng dụng thực tiễn rất cao như là: chữa bệnh tim mạch, tiểu đường, béo phì, gan nhiễm mỡ, giảm hàm lượng cholesterol trong máu… Tôi mong muốn được tiếp tục nghiên cứu sâu hơn về tạo chủng giống có khả năng tổng hợp Monacolin cao nhất để tạo ra sản phẩm mới phục vụ trong y học nhằm cải thiện, nâng cao sức khỏe cộng đồng.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu Tiếng việt :
1. Phan To Nga, Vu Nguyen Thanh (2005) ứng dụng của Monascus purpureus trong sản xuất thực phẩm chức năng (chứa Lovastatin) và khảo sát các điều kiện nuôi cấy cho 2 chủng nấm mốc Monascus.
2. Phan Việt Cẩm, Nguyễn Ngọc Tú. Báo cáo thí nghiệm thu đề tài cấp Bộ Công Nghiệp năm 2000: “Nghiên cứu tạo tiền sinh tố A bằng phương pháp vi sinh vật”. Phân viện Công Nghiệp Thực Phẩm tại Thành phố Hồ Chí Minh.
3. Phan Tố Nga và Phan Thị Sửu. Báo cáo thí nghiệm thu đề tài cấp Bộ Công Nghiệp năm 2001: “Nghiên cứu công nghệ khai thác chất màu thực phẩm từ thực vật và vi sinh vật”. Viện Công Nghiệp Thực Phẩm.
4. Phan Tố Nga. Báo cáo thí nghiệm thu đề tài cấp Bộ Công nghiệp năm 2002: “Nghiên cứu dạng chế phẩm màu từ vi sinh vật và ứng dụng vào một số thực phẩm”. Viện Viện Công Nghiệp Thực Phẩm.
5. Trương Thị Hòa, Phan Tố Nga. Báo cáo thí nghiệm thu đề tài cấp Bộ Công Nghiệp năm 2001: Nghiên cứu sử dụng nấm men bia và nấm men đỏ trong công nghiệp chế biến thực phẩm và thức ăn gia súc”. Viện Công Nghiệp Thực Phẩm.
6. Nguyễn Thị Hoài Trâm. Báo cáo tổng kết đề tài cấp Nhà Nước mã số KC.04.27: “Nghiên cứu xây dựng qui trình công nghệ vi sinh để sản xuất một số chế phẩm sinh học dùng trong công nghiệp chế biến thực phẩm”. Viện Công Nghiệp Thực Phẩm- Bộ Khoa Học Công Nghệ năm 2006.
7. Lương Đức Phẩm, Hồ Sưởng. Vi sinh tổng hợp, Nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật.
Tài liệu Tiếng Anh:
8. Ahn J, Jung J, Hyung W, Haam S, Shin C (2006). Enhancement of Monascus pigment production by the culture of Monascus sp. J101 at low temperature. Biotechol Prog 22 (1): 338-40.
9. Babitha S, Soccol CR, Pandey A (2007). Effect of stress on growth, pigment production and morphology of Monascus sp. In solid cultures. J Basic Microiology 47 (2): 118-126.
10. Babitha A, Soccol CR, Pandey A (2007). Soild–state fermentation for the production of Monascus pigment from jackfruit seed.
Bioresour Technol. 98 (8): 1554-1560.
11. Chen MH, Johns (1993). Effect of pH and nitrogen source on pigment production by Monascus purpureus. Appl Microbiol Biotechnol 40: 123-138.
12. Chen MH, Johns (1994). Effect of cacrbon source on ethanol and pigment production by Monascus purpureus. Enzyme Microb. Technol 16: 585-590.
13. Endo A (1979). A new hypocholesterolemic agent produced by a
14. Endo A (1980). Monacolin K, a new hypocholesterolemic agent that specifically inhibits 3-hydroxy-3methylglutaryl coenzyme A reductase. Journal of antibiotic 33: 334-336.
15. Endo A, Hasumi K and S. Negishi (1985). Monacolin J and L, new inhibitors of cholesterol biosynthesis produced by Monascus ruber. Journal of antibiotic 38: 420-422.
16. Evan PJ and HY Wang (1984). Pigment production from immobilized Monascus sp. Utilizing polymeric resin adsorption.
Appl and Environmental Microbiology 47 (6): 1323-1326.
17. Fenice M, Federici F, Selbamann L, Petruccioli M (2000). Repeated-batch production of pigments by immobilised Monascus purpureus. J Biotechnol 80 (3): 271-276.
18. Hajjaj H, Klaebe A, Goma G, Blanc P, Barbies and Francois J (2000). Medium chain Fatty acids affect citrinin production in the filamentous fungus Monascus ruber. Appl and Environmental Microbiology 66 (3): 1120-1125.
19. Huang HN, Hua YY, Bao GR and Xie LH (2006). The Quantification of Monacolin K in some red yeast rice form Fujian province and the comparison of the other product. Chem/ Pharm. Bull. 54 (5): 687-689.
20. Krairak S, Yamamura K, Irie R, Nakajima M, Shimizu H, Chim- Anage P, yongsmith B and S. Shioya (2000). Maximizing yellow pigment production in fed batch culture of Monascus sp .Journal og biocence and Bioengineering 90 (4): 363-367.
21. Lee CL, Wang J J, Kuo SL, Pan TM (2006). Monascus
cholesterol – lowering agent- monacolin K and antiinflammation agent – monascin. Appl microbiol Biotechnol 72 (6): 1254-1262.
22. Lin CF and H Iizuka (1982). Production of extracellular pigment by a mutant of Monascus kaoliang sp. now. Appl and Environmental Microbiololy 43 (3): 671-676.
23. Miyake T, Mori S, Kii T, Okuno T, Usui Y, Sato F, Sammoto H, Watanabe A, Kariyama M (2005). Light effects on cell development and secondary metabolism in Monascus s. J Ind Microbiol Biotechnol 32 (3): 103-108.
24. Suh SH, Rheem S, Mah JH, Lee W, Byun MW, Hwang HJ (2007). Optimization of production of monacolin F from gamma- Irradiated Monascus mutant by use of response surface methodology. J Med Food 10 (3): 408-415.
25. Teng SS, Feldheim W (2001). Anka and pigment production . J Ind Micribiol Biotechnol 26 (5): 280-282.
26. Wang UL, Houng JY, Chang HS, Roger–Chien H and Hsu WH (1998). Selection of drug-resistant mutant of Monascus pilosus for enhanced monacolin K production. J. Chinese Agric. Chem. Soc.
36: 192-200.
27. Zhao Hai (1998). Production of Monacolin by Monascus purpureus on rice solid state fermentation. International symposium on Monascus 1998. 19-13. Jun. Tolous. France.
28. Zhao Hai (2000). Application of Monascus products in China. The fourth international symposium on nature colorants. 2-5 April 2000, San Diego. USA.
29. Zhao Hai (2002). Research and Development of Monascus
Product for cholesterol lowering. Capital Medicine. 2002.9.P20.
30. Chiun- Chuang R. Wang, Ph. D.(2007). Investigation on Monacolin K Thermal Degradation Kinetics Analysis and Healthy Effects of Monascus- fermented Products.
31. Ming- Ho Chen, Mical Engineering (1993). Appl Microbiol Biotechnol 40: 132- 138.
32. Nguyen Thi Hoai Tram. Study on effectively of Rushton and Draft tube fermentors to yield of β-carotene producing Blakeslea trispora WH2. Industrial Review of VietNam. Nº4: 21-24 (2006).
33. Do Thi Thuy Le, Nguyen Thanh Ha, Bui Thi Hong Phuong, Le Van Trong, Nguyen Thi Hoai Tram. Study on enhanca the β- carotene production by filamentous fungal strains of Blakeslea trispora. In Proceeding of Regional Symposium on Chemical Engineering 2005-RSCE “New Trend in technology towards Sustainable Development”. Hanoi, VietNam Nov 30-Dec 2, 2005: 354-361 (2005).
34. Nguyen Thi Hoai Tram, Pham Thi Thu, Do Thi Thuy Le. Study on biosynthesis of β-carotene by two filamentous fungal strains WH1 and WH2 of Blakeslea trispora. Journal of Biotechnology 2