3. ỨNG DỤNG CỦA MONASCUS
3.2.Ứng dụng tron gy học
Bản mô tả đầu tiên về loài nấm mốc đỏ đã xuất hiện cách đây hơn 200 năm trong một công trình nghiên cứu chuyên đề của Li Shin-Chun (1590). Quyển sách này đã miêu tả việc ứng dụng của sắc tố như là một chất màu và như là thuốc để điều trị cho rất nhiều loại bệnh khác nhau. Điều thú vị hơn,
gạo lên men mốc đỏ cũng đã được nói đến trong các tài liệu về thuốc cổ xưa như trong cuốn Ben Cao Gang Mu của Li Shi-zhen về đặc tính làm tăng khả năng tiêu hóa và tái tạo máu ( Heber và cs 1990). Theo Li, Shin-Chun (1590) thì gạo lên men mốc đỏ có tác dụng cải thiện thể chất rất hiệu quả.
Sau một thời gian dài thử nghiệm trên động vật (Li và cs, 1998), gạo lên men mốc đỏ đã được thử nghiệm trên hai người tình nguyện và theo nghiên cứu tỉ mỉ về phương diện lâm sàng thì chúng được coi là thuốc làm giảm cholesterol. Trong một nghiên cứu, cả hai người một nam, một nữ đã dùng 1,2g gạo lên men đỏ 1 ngày (xấp xỉ 5mg monacolins) trong vòng hai tháng đã làm giảm một lượng đáng kể cholesterol (Wang và cs, 1997).[25]. Hơn nữa, nhưng người sử dụng gạo lên men đỏ đã thấy tăng đáng kể hàm lượng HDL cholesterol (tốt cho sức khỏe) và làm giảm lượng LDL cholesterol ( không tốt cho sức khỏe). Sự làm giảm hàm lượng triglyceride cũng được quan sát thấy ở những người sử dụng gạo lên men mốc đỏ (Quin và cs ,1997-1998).
Heber và cs (1999) quan sát thấy chế độ ăn kiêng có kèm thêm gạo lên men mốc đỏ, ở người lớn tại Mỹ, đã làm giảm một cách hiệu quả hàm lượng lipid, ông cho rằng đây là hiệu quả do gạo lên men mốc đỏ. Thử nghiệm được thực hiện với 83 người có lượng lipid huyết và HDL cholesterol cao nhưng không sử dụng các loại thuốc làm giảm hàm lượng lipid. Những người này đã dùng gạo lên men đỏ (2,4g/ ngày) hoặc uống thuốc trấn an và được cung cấp chế độ ăn với 30% năng lượng từ chất béo, dưới 10% từ chất béo bão hòa và dưới 300mg cholesterol một ngày. Đến tuần thứ 8, 9, 10, 11, 12 tiến hành thu thập số liệu về tổng lượng cholesterol, tổng lượng triglyceride và hàm lượng HDL và LDL cholesterol. Sau tám tuần, nhóm người dùng gạo lên men mốc đỏ đã có sự khác biệt hẳn với nhóm chỉ sử dụng thuốc trấn an vì đã làm giảm đáng kể về tổng lượng cholesterol cũng như LDL cholesterol và tổng lượng triglyceride. Chỉ có hàm lượng HDL cholesterol thì không thay đổi đáng kể. Gạo lên men đỏ đã có tác dụng rất hiệu quả trong việc làm giảm tổng lương
cholesterol, LDL cholesterol và tổng lượng triglyceride so với thuốc trấn an. Để hiểu sâu hơn về hiệu quả của gạo lên men đỏ, Wang và cs (1997) đã tiến hành một thí nghiệm ngẫu nhiên, thử nghiệm riêng lẻ với 502 bệnh nhân đã bị chuẩn đoán bị tăng lipid huyết. Với nhóm sử dụng gạo lên men mốc đỏ thì đã có sự giảm rõ rệt của lipid huyết (Wang và cs. 1997). [25].
Một trong những lợi ích của gạo lên men đỏ là nó ngăn chặn các bệnh về tim mạch. Một nghiên cứu của Trung Quốc đã chứng minh phần chiết của gạo lên men đỏ đã làm giảm kháng insulin và lượng glucose trong máu của nhóm bệnh nhân bị đái đường typ ІІ là kháng insulin và làm giảm lượng đường dự trữ trong cơ thể thì gạo lên men mốc đỏ được sử dụng để làm tăng độ nhạy với insulin cho những người bị bệnh đái đường thậm chí cả những người không có hàm lượng lipid cao. [30].
Hiện nay các chế phẩm từ Monascus purpureus được sản xuất rộng rãi ở nhiều quốc gia. Các chế phẩm này có thể bao gồm Monascus purpureus dạng thô, dịch chiết Monascus purpureus, và các chất tinh chế từ chúng. Sản phẩm có chứa hàm lượng Monacolin 90 mg-10.000 mg/kg. Các chế phẩm được áp dụng ở dạng viên nén, con nhộng , dạng kem và dạng bổ sung cho thực phẩm. Chế phẩm của Monascus purpureus tồn tại cả ở dạng thực phẩm chức năng và dược liệu. Solaray (Mỹ), InVite Health (Mỹ), Morning star health (Mỹ), Terra vita (Balan), Allok GmbH (Đức), Hangzhou Gosun Techriologies Co., Ltd (Trung Quốc), YBS (Nhật)…là một số trong nhiều công ty cung cấp thực phẩm chức năng và dược liệu từ Monascus purpureus.
4. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU, SẢN XUẤT VÀ ỨNG DỤNG
MONASCUS 4.1. Trên thế giới
Từ các triều đại Trung Hoa cổ xưa, người Trung Quốc đã phát hiện ra nấm mốc đỏ Monascus, xây dựng công nghệ lên men theo phương pháp bề mặt trên cơ chất là gạo đã được ngâm và hấp chính, và sử dụng các sản phẩm của chúng trong bảo quản và tạo màu sản phẩm: thịt, cá, lên men rượu vang gạo. Năm 1956, nhà học giả triều Minh Li Shezhen đã tập hợp các tài liệu về công nghệ sản xuất và ứng dụng Monascus trong chế biến thực phẩm và tăng cường sức khỏe với công dụng kích thích tuần hoàn máu, ngăn cản các triệu chứng các bệnh của hệ thống tiêu hóa, tim mạch một cách chi tiết trong cuốn sách y học nổi tiếng của ông “Ben Cao Giang Mu”. Cho đến ngày nay, công nghệ đã được mô tả trong quyển sách này vẫn còn được sử dụng để sản xuất gạo nấm đỏ “Red Yeast Rice” từ Monascus, và các phương pháp sản xuất các sản phẩm từ Monascus của nhiều nước Châu Á như Nhật Bản, Ấn Độ, Hàn Quốc...đều được cho là bắt nguồn từ Trung Quốc. Các sản phẩm từ Monascus
được sử dụng trong chế biến thực phẩm hiện nay ở Trung Quốc bao gồm: + Ku Qu và Qing Qu: Dùng để sản xuất rượu vang đỏ, chao đỏ và các sản phẩm dầm dấm. Các enzyme amylaza, glucoamylaza và chất màu từ
Monascus đóng vao trò chính trong quá trình sản xuất và các sản phẩm thực phẩm trên.
+ Se Qu: Dùng chủ yếu trong các sản phẩm thịt. Se Qu được sản xuất chủ yếu theo phương pháp lên men bề mặt với giá trị màu khoảng 800-1000 đơn vị, sản lượng hàng năm là khoảng 400 tấn, trong đó một nửa được xuất khẩu sang các nước khác. Hiện nay, công ty sản xuất chất màu ở Nixia , Tây Bắc Trung Quốc đã sản xuất chất màu từ Monascus theo phương pháp lên
men chìm qui mô công nghiệp với sản lượng hơn 50 tấn/năm, chất lượng sản phẩm rất tốt, chủ yếu để xuất khẩu với cường độ màu đạt 6000 đơn vị với giá bán gấp 3 lần (30.000 nhân dân tệ /tấn) so với chất màu sản xuất theo phương pháp bề mặt.
+ Zhi Ha Qu: Là sản phẩm mới của Monascus được sử dụng để sản xuất loại rượu vang trắng nổi tiếng của Trung Quốc Zhao-Xin với đặc trưng là hàm lượng ester rất cao do vai trò của các enzyme esteraza tạo hương của các chủng Monascus được sử dụng trong quá trình lên men.
+ Năm 1979, giáo sư người Nhật Bản Endo A đã phát hiện và công bố rằng các chủng nấm sợi thuộc chi Monascus có thể tổng hợp hoạt chất có khả năng hạ cholesterol máu (sau đó được gọi là Monacolin) và một số chất có cấu trúc tương đồng với nó từ quá trình nuôi cấy lên men chìm. Các hoạt chất này ức chế Enzyme HMG-Coa khử là enzyme có chức năng tổng hợp cholesterol trong cơ thể. Từ đó đến nay đã có rất nhiều công trình nghiên cứu về Monacolin được công bố ở Trung Quốc và nhiều quốc gia trên Thế Giới như: Hàn Quốc, Nhật Bản, Ấn Độ… Gần đây các nước Châu Âu và Châu Mỹ cũng đã quan tâm nghiên cứu khai thác các hợp chất có hoạt tính sinh học của
Monascus như Monacolin, GABA (Teng và Feldheim,2001). Một số các sản phẩm hạ lipid máu từ Monascus bao gồm:
- Cholestin: Là một trong các dòng sản phẩm chứa Monacolin K từ
Monascus có tên Trung Quốc là Hong Qu, năm 1999 đã được cơ quan quản lý thực phẩm và dược phẩm Hoa Kỳ (FDA) cho phép nhập khẩu và bán rộng rãi tại Mỹ như thực phẩm chức năng để ngăn ngừa và điều trị bệnh mỡ máu cao, tim mạch và tiểu đường…
- Xue Zhin Kang và Zhi Bi Tuo: Các sản phẩm này được sử dụng chủ yếu ở Trung Quốc và đến năm 1999 đã xuất khẩu sang Mỹ.
- Monascus Redt và Monachollred yeast là các sản phẩm được bán rộng rãi ở Châu Âu không cần đơn thuốc để ngăn ngừa và điều trị bệnh mỡ máu cao do hãng Allok GmbH có trụ sở tại thành phố Munich sản xuất từ
Monascus lên men trên cơ chất bột gạo.
Việc nghiên cứu, sản xuất và ứng dụng các chất màu đỏ, vàng và Monacolin từ Monascus trong công nghiệp thực phẩm và y tế đã được phát triển mạnh mẽ ở nhiều nước trên Thế Giới từ những năm 1980 đến nay có thể tóm tắt theo các hướng chính sau:
+ Nghiên cứu nâng cao hiệu suất tổng hợp sắc màu đỏ và Monacolin bằng các biện pháp công nghệ như nghiên cứu thành phần dinh dưỡng cacbon, nitơ, điều kiện nuôi cấy và nhiệt độ pH, tỷ lệ nhân giống: cơ chất rắn không chỉ có gạo theo phương pháp truyền thống mà còn được dùng là lúa mỳ, ngô, bột bánh mỳ vụn, nguồn cacbon nito thích hợp cho nuôi cấy thu nhận Monacolin là hỗn hợp maltoza và glyxerol, và peptone đạt hiệu suất 444mg/lit (Miyake và cs.2005), nhân giống bằng bào tử hoặc sinh khối sợi nấm được nhân giống trên môi trường lỏng, sử dụng bí quyết bổ sung các tiền chất có tác dụng kích thích quá trình trao đổi chất thứ cấp của Monascus
(Zhao Hai. 1998, 2000. và 2002, Chen và cs, 1993, 1994), Krairak và cs , 2000, Evans và Wang, 1984, Lee và cs, 2006).
+ Sử dụng kỹ thuật đột biến để tạo các chủng Monascus đột biến có khả năng tổng hợp Monacolin cao và sắc tố màu vàng: Chủng đột biến Monascus kaoliang sp.nov.R 10847 đã tạo các sắc tố màu từ da cam (đo ở bước sóng 400nm) đến đỏ thẫm (500nm) cao hơn 60-100 lần so với chủng tự nhiên
Monascus Kaoliang sp.nov.F2 (ATCC 26264) khi nuôi cấy bề mặt trên cơ chất vụn bánh mỳ hấp,tương ứng là 62,6 và 3852 đơn vị và 46,4 và 4817 đơn vị cường độ màu (Lin và Izuka, 1982), chủng Monascus sp. HB-đột biến để tạo sắc tố màu vàng đạt cường độ 200 đơn vị /ml khi nuôi cấy chìm trên cơ chất bột ngô (Zhao Hai, 2002), hàm lượng Monacolin tăng lên 725 mg/lít
bằng chủng đột biến Monascus pilosus MK1 (Wang và cs,1998, Miyake và cs, 2005), Chủng đột biến Monascus sp. KU609 tổng hợp Monacolin K tăng 100 lần so với chủng bố mẹ (Suh và cs, 2007).
+ Các công nghệ lên men bề mặt, lên men chìm theo mẻ và tiếp thêm môi trường nguồn dinh dưỡng đã được cải tiến, hàm lượng Monacolin đạt 0,28-0,35 mg/gam cơ chất theo phương pháp nuôi cấy bề mặt và 0,11 mg/gam theo phương pháp nuôi cấy chìm (Zhao Hai, 2000) chủng đột biến Monascus
sp. KB20M10.2 khi nuôi cấy chìm theo mẻ có thể tiếp thêm môi trường đã đạt hàm lượng màu vàng tối đa là 1015 đơn vị cường độ màu/ml so với 149 đơn vị/ml khi nuôi cấy theo mẻ (Krairak và cs, 2000, Fenice và cs, 2000) đồng thời làm giảm tối đa hoặc giảm hoàn toàn độc chất citrinin (Fenice và cs, 2000, Hajjaj và cs, 2000), sử dụng công nghệ cố định tế bào đã làm tăng hàm lượng màu khi nuôi cấy Monascus sp. NRRL 1993 (Evans và Wang, 1984)
+ Các thử nghiệm lâm sàng tại Trung Quốc, Mỹ đã chứng minh rằng các thực phẩm chức năng và thuốc chưa Monacolin K từ Monascus có tác dụng giảm cholesterol tổng số 18%, giảm lượng triglyxerit 35%, giảm lượng cholesterol xấu 24%, giảm chỉ số tạo khối mỡ trong mạch máu 30% và làm tăng hàm lượng cholesterol tốt 18,3% (Zhao Hai, 2002). Chúng được dùng trong ngăn ngừa và điều trị các bệnh cholesterol cao, mỡ máu cao,huyết áp cao, tim mạch ở dạng bột, dạng viêm nén, viên nang chứa 2 hoặc 4 mg Monacolin K/viên 500 hoặc 1000 mg.[6]. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
4.2. Ở Việt Nam
Ở Việt Nam việc nghiên cứu, sản xuất và sử dụng các chất màu, đặc biệt là các chất có hoạt tính sinh học từ vi sinh vật còn khá hạn chế. Có thể kể tên hai sản phẩm được sử dụng đầu tiên về lĩnh vực này là Chao đỏ (còn có tên gọi là đậu phụ nhự), sản xuất bằng cách lên men đậu phụ với nấm mốc
Monascus, sản phẩm có giá trị dinh dưỡng cao, màu đỏ với mùi vị rất đặc trưng, và cốm bổ canxi sản suất từ sinh khối nấm men sau sản suất bia có hàm
lượng protein , vitamin và khoáng cao. Một số công trình nghiên cứu về các chất màu và hoạt chất sinh học từ vi sinh vật,đặc biệt từ nấm mốc và nấm men có thể thống kê như sau :
+ Từ cuối những năm 1960 và đầu những năm 1970, các nhà khoa học Viện Công nghiệp thực phẩm đã tiến hành nghiên cứu hoàn thiện công nghệ sản suất chao đỏ bằng chủng nấm sợi Monascus purpureus. Sản phẩm đạt chất lượng cao, không có độc tố nấm. Công nghệ và chủng nấm đã được bổ biến và cung cấp rộng rãi cho các cơ sở sản suất thực phẩm ở Miền Bắc.
+ Năm 2000-2002, trong các đề tài cấp Bộ Công Nghiệp “ Nghiên cứu công nghệ khai thác chất màu thực phẩm từ thực vật và vi sinh vật ” và “Nghiên cứu dạng chế phẩm màu từ vi sinh vật và ứng dụng vào một số thực phẩm” Sắc tố đỏ của Monascus đã được tổng hợp theo phương pháp nuôi cấy bề mặt quy mô phòng thí nghiệm. Hàm lượng màu đạt 106 mg/100 gam sinh khối khô Monascus sp. Sắc tố Monascus đã được trích ly từ sinh khối nấm bằng cồn và ứng dụng để tạo màu đỏ của xúc xích, rượu vang (Phan thị Sửu và Phan tố Nga, 2000, Phan tố Nga, 2002. Phan tố Nga và Vũ nguyên Thành, 2003).
PHẦN II. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.1. Nguyên liệu
2.1.1. Vi sinh vật, môi trường giữ giống, nhân giống, lên men
- Vi sinh vât: Chủng giống phục vụ nghiên cứu được lấy từ bộ sưu tập giống vi sinh vật Công Nghiệp Thực phẩm là: chủng nấm mốc Monascus purpureus 5085 được sử dụng cho nghiên cứu sản xuất chế phẩm nấm mốc đỏ.
- Môi trường giữ giống: Chủng nấm mốc Monascus purpureus 5085được bảo quản trên thạch PDA ở nhiệt độ 30ºC trong thời gian 7, 8 ngày.
- Nhân giống, lên men: Sau khi nuôi cấy trên môi trường thạch PDA trong 7 ngày ở 30ºC bào tử chuyển sang các bình tam giác chưa các môi trường lên men của nuôi cấy bề mặt (môi trường gạo), và nuôi cấy chìm (môi trường lỏng).
Môi trường nuôi cấy chìm gồm có: + Môi trường nhân giống:
Thành phần Hàm lượng (g/l) Meat extract 3,0
Peptone 5,0 Glucose 10 + Môi trường lên men chìm:
Thành phần Hàm lượng (g/l) Glucose 10
KH2PO4 1,5 K2HPO4 1,5 NaCl 0,4 FeSO4.7H2O 0,01 ZnSO4.7H2O 0,01 YE (Yeast extract) 1,0 MSG (Monosodium glutamate) 7,6 2.1.2. Hóa chất
Glucose, peptone, MSG (Monosodium glutamate), YE (Yeast extract), K2HPO4, KH2PO4, MgSO4.7H2O, NaNO3, (NH4)3PO4, (NH4)2HPO4, (NH4)2SO4 , Meat extract, NaCl, FeSO4.7H2O, ZnSO4.7H2O, Axit HCl, Kiềm NaOH, Cao malt (Malt extract), Phenolphtalein (Meck-Đức), PDA chuẩn
Các dung môi chạy TLC: (Chloroforme, Methanol, Benzene), và một vài hóa chất trong phòng thí nghiệm khác.
2.1.3. Thiết bị
- Tủ cấy vô trùng Esco ( Nhật Bản). - Tủ ấm nuôi cấy Sanyo (Nhật Bản). - Máy lắc Shel Lab (Nhật Bản). - Máy Vortex (Đan Mạch).
- Máy ly tâm effendor (Nhật Bản). - Nồi hấp Tomy SS-325 (Nhật Bản). - Tủ Sấy Sanyo (Nhật Bản).
- Cân phân tích Shimadzu BW320D (Nhật Bản). - Cân kĩ thuật (Nhật bản).
- Máy đo pH (Nhật Bản).
- Thiết bị sắc ký lỏng cao áp HPLC (Shimadzu, Nhật). - Máy sấy phun công nghiệp.
- Máy đo mật độ quang Shimadzu (Nhật Bản). - Máy đo UV- VIS (Nhật bản).
- Các bình tam giác 250ml, 500ml.
- Cốc thủy tinh, pipet, ống đong, và các thiết bị trong phòng thí nghiệm khác.
2.2. Phương pháp
2.2.1. Nuôi cấy theo phương pháp bề mặt (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Chuẩn bị nút bông: Rửa sạch các ống thủy tinh, bình tam giác 250ml và 500ml để khô rồi tiến hành làm nút sau đó đem hấp thanh trùng ở nhiệt độ 121ºC trong 15 phút.
- Chuẩn bị môi trường PDA để giữ giống và nhân giống: Ta sử dụng PDA dạng thô (PDA chuẩn của Difco) pha với nước cất theo tỉ lệ 1:2,5 rồi đun sôi qua lưới Amiang cho tan thạch, để nguội sau đó đổ vào mỗi ống nghiệm thủy tinh 12ml môi trường, rồi đem hấp thanh trùng ở 121ºC trong 15 phút, để nguội cho vào tủ lạnh.
- Chuẩn bị môi trường lên men (môi trường lên men ở đây là môi trường rắn trên cơ chất là gạo): Đem gạo không rửa nấu chín theo tỉ lệ cứ 100g gạo