3. ỨNG DỤNG CỦA MONASCUS
2.1.1. Vi sinh vật, môi trường giữ giống, nhân giống, lên men
- Vi sinh vât: Chủng giống phục vụ nghiên cứu được lấy từ bộ sưu tập giống vi sinh vật Công Nghiệp Thực phẩm là: chủng nấm mốc Monascus purpureus 5085 được sử dụng cho nghiên cứu sản xuất chế phẩm nấm mốc đỏ.
- Môi trường giữ giống: Chủng nấm mốc Monascus purpureus 5085được bảo quản trên thạch PDA ở nhiệt độ 30ºC trong thời gian 7, 8 ngày.
- Nhân giống, lên men: Sau khi nuôi cấy trên môi trường thạch PDA trong 7 ngày ở 30ºC bào tử chuyển sang các bình tam giác chưa các môi trường lên men của nuôi cấy bề mặt (môi trường gạo), và nuôi cấy chìm (môi trường lỏng).
Môi trường nuôi cấy chìm gồm có: + Môi trường nhân giống:
Thành phần Hàm lượng (g/l) Meat extract 3,0
Peptone 5,0 Glucose 10 + Môi trường lên men chìm:
Thành phần Hàm lượng (g/l) Glucose 10
KH2PO4 1,5 K2HPO4 1,5 NaCl 0,4 FeSO4.7H2O 0,01 ZnSO4.7H2O 0,01 YE (Yeast extract) 1,0 MSG (Monosodium glutamate) 7,6 2.1.2. Hóa chất
Glucose, peptone, MSG (Monosodium glutamate), YE (Yeast extract), K2HPO4, KH2PO4, MgSO4.7H2O, NaNO3, (NH4)3PO4, (NH4)2HPO4, (NH4)2SO4 , Meat extract, NaCl, FeSO4.7H2O, ZnSO4.7H2O, Axit HCl, Kiềm NaOH, Cao malt (Malt extract), Phenolphtalein (Meck-Đức), PDA chuẩn
Các dung môi chạy TLC: (Chloroforme, Methanol, Benzene), và một vài hóa chất trong phòng thí nghiệm khác.
2.1.3. Thiết bị
- Tủ cấy vô trùng Esco ( Nhật Bản). - Tủ ấm nuôi cấy Sanyo (Nhật Bản). - Máy lắc Shel Lab (Nhật Bản). - Máy Vortex (Đan Mạch).
- Máy ly tâm effendor (Nhật Bản). - Nồi hấp Tomy SS-325 (Nhật Bản). - Tủ Sấy Sanyo (Nhật Bản).
- Cân phân tích Shimadzu BW320D (Nhật Bản). - Cân kĩ thuật (Nhật bản).
- Máy đo pH (Nhật Bản).
- Thiết bị sắc ký lỏng cao áp HPLC (Shimadzu, Nhật). - Máy sấy phun công nghiệp.
- Máy đo mật độ quang Shimadzu (Nhật Bản). - Máy đo UV- VIS (Nhật bản).
- Các bình tam giác 250ml, 500ml.
- Cốc thủy tinh, pipet, ống đong, và các thiết bị trong phòng thí nghiệm khác.
2.2. Phương pháp
2.2.1. Nuôi cấy theo phương pháp bề mặt
- Chuẩn bị nút bông: Rửa sạch các ống thủy tinh, bình tam giác 250ml và 500ml để khô rồi tiến hành làm nút sau đó đem hấp thanh trùng ở nhiệt độ 121ºC trong 15 phút.
- Chuẩn bị môi trường PDA để giữ giống và nhân giống: Ta sử dụng PDA dạng thô (PDA chuẩn của Difco) pha với nước cất theo tỉ lệ 1:2,5 rồi đun sôi qua lưới Amiang cho tan thạch, để nguội sau đó đổ vào mỗi ống nghiệm thủy tinh 12ml môi trường, rồi đem hấp thanh trùng ở 121ºC trong 15 phút, để nguội cho vào tủ lạnh.
- Chuẩn bị môi trường lên men (môi trường lên men ở đây là môi trường rắn trên cơ chất là gạo): Đem gạo không rửa nấu chín theo tỉ lệ cứ 100g gạo khô với 70ml nước, nấu xong để nguội cơm rồi cho vào các bình tam giác 500ml đã thanh trùng tuyệt đối mỗi bình 50g gạo, sau đó đem hấp thanh trùng ở nhiệt độ 121ºC trong 15 phút, rồi cho vào tủ cấy để nguội bật đèn tím chờ cấy giống.
- Lên men: Sau khi giống được nuôi cấy trên môi trường thạch PDA trong thời gian 8 ngày ở nhiệt độ 30ºC bào tử sẽ phát triển kín trên bề mặt thạch và có màu đỏ, ta tiến hành cấy giống bằng hệ sợi hoặc bào tử:
+ Hệ sợi: Dùng que cấy lấy bào tử phát triển trên môi trường thạch, cấy trực tiếp vào môi trường trên ngọn lửa đèn cồn.
+ Bào tử: Trên ngọn lửa đèn cồn ta tiến hành hút 10ml nước cất đã vô trùng vào trong ống thủy tinh chứa giống, rồi dùng que cấy gạt nhẹ những bào tử trên thạch hòa tan vào nước, sau đó dùng pipet5 đã thanh trùng hút 5ml nước cất chứa bào tử đó bơm vào trong môi trường lên men (ở đây là 50g gạo trong bình tam giác 500ml).
Sau khi cấy giống xong ta đưa các bình tam giác 500ml đó vào tủ ấm nuôi tĩnh ở nhiệt độ 30ºC trong thời gian 8 ngày.
2.2.2. Nuôi cấy theo phương pháp chìm
- Chuẩn bị môi trường lên men: Trong nuôi cấy chìm giống được tiến hành nhân giống qua 2 cấp:
+ Giống cấp 1: Meat extract 3g/l, Peptone 5g/l, và Glucose 10g/l đem hòa tan với nước cất, sau đó đổ vào mỗi ống nghiệm vô trùng 10ml, rồi đem hấp thanh trùng ở 121ºC trong thời gian 20 phút, để nguội cho vào tủ vô trùng bật đèn tím chờ cấy giống.
+ Giống cấp 2: Glucose 10g/l; MgSO4.7H2O 4,8g/l; KH2PO4 1,5g/l; K2HPO4 1,5g/l; NaCl 0,4g/l; FeSO4 0,01g/l; ZnSO4 0,01g/l; YE (Yeast extract) 1g/l; MSG (Monosodium glutamate) 7,6g/l. Hòa tan vào nước cất chỉnh về pH=5,5 sau đó đong vào bình tam giác 500ml mỗi bình 90ml dịch môi trường,rồi đem hấp thanh trùng 121ºC trong 20 phút. Để nguội cho vào tủ vô trùng chờ tiếp giống cấp 1.
- Lên men: Sau khi giống được nuôi trên môi trường thạch PDA trong 7 ngày ở 30ºC, trên ngọn lửa đèn cồn ta dùng que cấy giống trực tiếp vào các ống thủy tinh chứa 10ml môi trường giống cấp 1, đem nuôi 15h trong tủ lắc ở nhiệt độ 30ºC, 150 vòng/phút. Sau 15h ta tiến hành tiếp giống cấp 1 vào các bình tam giác 500ml chứa 90ml dịch môi trường cấp 2 trên ngọn lửa đèn cồn. Cuối cùng ta đem các bình tam giác 500ml vừa được tiếp giống đó nuôi trong tủ lắc ở nhiệt độ 30ºC, 250 vòng/phút trong thời gian 5 ngày.
2.2.3. Phương pháp phân tích
2.2.3.1. Tách chiết chất màu và Monacolin từ các sinh khối lên men
- Với lên men bề mặt: Lấy tất cả sinh khối thu được đem tách chiết bằng các dung môi khác nhau như: Cồn, methanol, acetone, n-butanol, và H2O, dịch chiết được lọc qua màng lọc 0,45 µm .
- Với lên men chìm: Sinh khối được thu nhận bằng phương pháp lọc ly tâm, lấy 1 gam sinh khối đem chích ly với cồn, dịch chiết được lọc qua màng lọc 0,45 µm.
2.2.3.2. Phân tích chất màu của Monascus bằng phương pháp quang phổ
a. Chuẩn bị dịch đo: Lấy dịch chiết thu được từ lên men bề mặt, dịch lên men, dịch chiết sinh khối từ lên men chìm đem pha loãng ở các tỷ lệ nhất định rồi đem đo ở máy đo quang UV-VIS.
b. Đo cường độ màu ở các bước sóng:
- Màu đỏ: λ= 470 nm, và 500 nm.
- Màu da cam: λ= 400 nm, và 420 nm.
- Màu vàng: λ= 330 nm, và 370 nm.
c. Cách tính toán cường độ màu (Giả sử giá trị đo OD là A)
- Với lên men bề mặt: Cường độ màu/ gam sinh khối= (A) x (hệ số pha loãng) x (lượng dịch chiết từ 1 gam sinh khối)
- Với lên men chìm: Cường độ màu/ ml dịch chiết, dịch lên men= (A) x (hệ số pha loãng).
2.2.3.3. Phân tích chất màu và Monacolin bằng phương pháp sắc kí bản mỏng(TLC) (TLC)
a. Nguyên tắc:
Sắc kí lớp mỏng là một kĩ thuật sắc kí được dùng để tách các chất trong hỗn hợp. Phương pháp sắc kí lớp mỏng bao gồm pha tĩnh là một lớp mỏng các chất hấp phụ thường là silica gel, aluminium oxit hoặc celluloza được phủ trên một mặt phẳng chất trơ. Pha động bao gồm dung dịch cần phân tích được
hoà tan trong một dung môi thích hợp và được hút lên bản sắc kí bởi mao dẫn, tách dung dịch thí nghiệm dựa trên tính phân cực của các thành phần trong dung dịch.
Một vệt nhỏ dung dịch chứa mẫu thử được thấm lên bản sắc kí, khoảng 1cm từ dưới lên. Bản sắc kí sau đó được nhúng vào một dung môi thích hợp và được đặt vào trong một vật chứa có nắp. Dung môi di chuyển lên bản sắc kí bởi mao dẫn, gặp phải mẫu thử và dịch chuyển mẫu thử lên bản sắc kí. Các hợp chất khác nhau trong hỗn hợp mẫu thử dịch chuyển với tốc độ khác nhau do chúng có sức hút khác nhau đối với pha tĩnh và độ tan khác nhau trong dung môi. Các hợp chất được tách ra dựa trên sự cạnh tranh của chất tan và pha động để có được chỗ liên kết với pha tĩnh. Pha tĩnh trì hoãn sự di chuyển của các thành phần trong mẫu. Khi các thành phần này di chuyển qua hệ thống với tốc độ khác nhau, chúng sẽ được tách khỏi nhau theo thời gian. Kết quả là mỗi chất trong hỗn hợp được phân chia thành một vùng riêng biệt, ta thu được một sắc kí đồ trên bản mỏng.
b. Dung dịch chạy:
- Bao gồm: Chloroforme , Methanol, và Benzene. Dung dịch chạy được để trong bình kín tối màu.
c. Tiến hành chạy TLC:
- Sử dụng bản sắc kí nhôm. Bản TLC được sấy ở 105oC trong khoảng 3 phút.
- Nhỏ các giọt mẫu lên các điểm đã đánh dấu trên bản TLC, vừa nhỏ vừa sấy khô giọt mẫu. Mẫu phải được sấy khô mới nhỏ tiếp các giọt mẫu khác.
- Đặt cân bằng bản TLC trong bình sắc kí có chứa dung dịch chạy được pha theo tỷ lệ như trên ở nhiệt độ phòng, để chạy hết bản sắc kí trong khoảng 2 giờ.
- Sau khi đã chạy hết, bản TLC được lấy ra khỏi bình rồi cho vào tủ sấy, sấy ở nhiệt độ 105oC trong 5 phút.
- Sau đó lấy ra rồi nhuộm bản mỏng với hơi iodine hoặc quan sát UV ở bước sóng 254 nm để phát hiện Monacolin.
PHẦN ІІІ. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1. Sự phát triển của hệ sợi, bào tử chủng Monascus purpureus 5085
- Quan sát hình thái khuẩn lạc, hệ sợi chủng Monascus purpureus 5085 trên môi trường PDA.
Hình 5: Hình thái của M. purpureus phát triển trên môi trường PDA
* Nhận xét: Hình thái sợi quan sát dưới kính hiển vi có hệ sợi dài và
mảnh khi non thì có màu trắng ngà, và khi già đủ ngày nuôi cấy thì có màu đỏ. Hình thái khuẩn ty không có vách ngăn, thể quả chai tròn mọc trên cuống. Chất màu hình thành trong hệ sợi có hình dạng chữ nhật, kích thước tương đối đều nhau và có màu đỏ.
3.2. Nghiên cứu sự phát triển của chủng Monascus trên môi trường khácnhau nhau
- Theo dõi quá trình phát triển của chủng Monascus purpureus 5085 trên môi trường lên men bề mặt và lên men chìm trên bình tam giác 500ml. Kết quả thu được ở bảng 1.
Bảng 1: Quá trình phát triển của chủng Monascus purpureus 5085 trên môi trường lên men bề mặt và lên men chìm
Phư Phương pháp lên men Ngày lên men Quan sát hình thái Lên men bề mặt
Ngày 1,2 Sinh khối gạo chưa có sự thay đổi gì về màu sắc, giống chưa phát triển.
Ngày 3,4 Sinh khối gạo tơi, có lốm đốm đỏ xuất hiện Ngày 4,5 Sinh khối gạo hơi ướt có màu đỏ nhạt Ngày 6,7 Sinh khối gạo ướt có màu đỏ đậm hơn Ngày 7,8 Có sự thay đổi rõ rệt về màu sắc, giống
phát triển mạnh, sinh khối gạo ướt, bết có màu đỏ sậm.
Ngày 9,10 Màu đỏ của sinh khối gạo nhạt đi nhiều
Lên men chìm
Ngày 1,2 Dịch lên men chưa có sự thay đổi về màu sắc, dịch trong suốt.
Ngày 3,4
Dịch chuyển sang màu hơi vàng, bắt đầu xuất hiện sinh khối có màu trắng, vón cục, trơn.
Ngày 5 Có sự chuyển màu rõ nét dịch có màu đỏ, sinh khối nhiều có hình tròn, trơn.
Ngày 6,7 Mầu đỏ của dịch giảm đi, xuất hiện bào từ bám trên thành bình.
- Kết thúc quá trình lên men ta thu sinh khối đem phân tích chất mầu.
Lên men bề mặt Lên men chìm
Hình 6: Ảnh chạy dải màu của lên men bề mặt và lên men chìm trên máy đo quang UV-VIS.
- Qua hình 6 ta thấy rằng dải màu hấp thụ nhiều nhất ở bước sóng 370nm, 400nm hay nói cách khác khả năng tổng hợp màu vàng, da cam nhiều.
* Kết luận:
- Lên men bề mặt: Khối gạo chuyển từ mầu trắng sang lốm đốm đỏ, đến đỏ, đỏ sậm, bên trong hạt gạo cũng có mầu đỏ sậm Nếu kéo dài quá trình lên men từ 9-10 ngày mầu đỏ của khối gạo nhạt đi.
- Lên men chìm: Dịch lên men chuyển từ mầu màu trắng đục sang hồng nhạt, tới màu đỏ (màu dâu chín). Nếu kéo dài thời gian lên men từ 6-7 ngày xuất hiện bào từ bám trên thành bình. Nếu kéo dài thêm thời gian lên men 8 ngày, mầu đỏ của dịch giảm đi.
- Chủng Monascus purpureus 5085 đều phát triển tốt trên 2 môi trường lên men bề mặt và lên men chìm. Thời gian lên men càng dài lượng chất mầu tạo thành càng nhiều, nhưng nếu kéo dài thời gian lên men bề mặt quá 8 ngày và lên men chìm quá 5 ngày lượng mầu tạo thành giảm, nguồn dinh dưỡng cạn kiệt, xuất hiện bào tử bám trên thành bình và bề mặt gạo.
Do thời gian thực tập có hạn nên tôi chỉ tiến hành thí nghiệm theo phương pháp lên men chìm.
3.3. Nghiên cứu nâng cao khả năng tổng hợp chất mầu và Monacolin củachủng Monascus purpureus 5085 theo phương pháp lên men chìm chủng Monascus purpureus 5085 theo phương pháp lên men chìm
3.3.1. Lựa chọn thành phần môi trường nuôi cấy thích hợp
3.3.1.1. Nguồn dinh dưỡng cacbon
Tiến hành thí nghiệm trên môi trường lên men cơ bản với 5 nguồn cacbon khác nhau: Saccarose, glucose, cao malt, cao ngô, tinh bột. Kết quả thu được ở bảng 2.
Bảng 2: Ảnh hưởng của nguồn cacbon đến khả năng tổng hợp chất màu của chủng M. purpureus 5085
cacbon sau lên men (g/l)
sinh khối ướt
370 nm 400 nm Saccarose 10.6 67.8 75.1 Glucose 11.7 23.4 34.4 Cao malt 10.5 33.2 34.8 Cao ngô 11.4 28.6 34.2 Tinh bột 12.0 173.4 175.2 *Nhận xét:
- Lượng sinh khối thu được sau lên men tăng dần từ 10.5g/l→ 12.0g/l. - Chủng M. purpureus 5085 phát triển tốt trên môi trường: glucose, cao malt, cao ngô nhưng khả năng tổng hợp sắc tố mầu vàng, da cam thấp hơn so với mầu đỏ.
- Nguồn cacbon là tinh bột cho khả năng tổng hợp chất màu là cao nhất
so với các loại nguồn cacbon khác . Vì lượng sinh khối thu được nhiều nhất, cường độ mầu vàng, da cam cao nhất. Do vậy chọn nguồn cacbon là tinh bột cho các nghiên cứu tiếp theo.
* Tiến hành lên men với các nồng độ tinh bột khác nhau: 0.5%, 1%, 1.5%, 2%. Kết quả thu được ở dưới bảng 3.
Bảng 3: Ảnh hưởng của nồng độ tinh bột đến sự tổng hợp chất màu của
M. purpureus 5085
Nồng độ tinh bột
(%)
Lượng sinh khối ướt sau
lên men
Cường độ màu/gam sinh khối ướt
(g/l) 0.5 12.1 65.4 73.6 1.0 12.5 157.8 198.4 1.5 13.0 172.2 187.8 2.0 12.6 121.2 130.4 * Nhận xét:
- Lượng sinh khối tăng từ 12.1g/l tới 13.0g/l khi ta tăng nồng độ tinh bột từ 0.5% tới 2%.
- Cường độ mầu vàng, da cam tăng dần lên theo nồng độ, nhưng khi tăng lượng tinh bột tới 2% thì cường độ mầu vàng, da cam lại giảm.
- Khi bổ sung tinh bột với nồng độ 1.5% thì lượng sinh khối tạo thành nhiều nhất, cường độ mầu vàng, da cam là cao nhất (ở bước sóng 370nm cường độ mầu là 172.2, tại bước sóng 400nm là 187.8). Như vậy chọn tinh bột 1.5% là thích hợp nhất cho các nghiên cứu tiếp theo của chủng
M.purpureus 5085.
3.3.1.2. Nguồn dinh dưỡng nitơ
Tiến hành thí nghiệm trên môi trường lên men cơ bản với 6 nguồn nitơ là: cao nấm men, cao ngô, bột nấm men, tryptone, đậu tương, pepton. Kết quả thể hiện ở bảng 4.
Bảng 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn nitơ đến khả năng tổng hợp chất màu của M. purpureus 5085
Nguồn nitơ Hàm lượng sinh khối ướt
(g/l)
Cường độ màu/gam sinh khối ướt
370 nm 400 nm 500 nm Cao ngô 14.2 179.1 198.5 66.1 Bột nấm men 13.5 92.4 96.4 38.4 Tryptone 12.7 169.7 188.8 62.7 Đậu tương 10.3 84.9 86.2 40.9 Peptone 14.7 159.5 184.1 88.5 Cao nấm men 14.1 192.6 208.3 65.0 * Nhận xét:
- Nguồn dinh dưỡng nitơ ảnh hưởng rõ rệt đến sinh trưởng và sinh tổng
hợp sắc tố. Cùng chủng giống nguồn nitơ khác nhau cho hàm lượng sắc tố thu được khác nhau.
- Khi ta bổ sung cao nấm men vào môi trường lên men thì hàm lượng sinh khối thu được nhiều nhất, khả năng sinh tổng hợp mầu vàng, da cam là cao nhất (tại bước sóng 370nmn cường độ mầu là 192.6 bước sóng 400nm là