a. Phương pháp nấu môi trường
• Môi trường PGA (Potato- Glucose- Agar) Thành phần:
+ Khoai tây 200 g + Glucose 20 g + Agar 20 g + Nước cất 1000 ml
Cách điều chế: Khoai tây gọt vỏ, rửa sạch, thái lát mỏng cho vào nồi cùng với 1000 ml nước cất đun sôi khoảng 1 giờ. Lọc qua vải lọc, bổ sung nước cất cho đủ 1000 ml. Cho agar và glucose vào khuấy đều cho agar tan hết, đun cho đến khi sôi. Cho môi trường này vào bình tam giác đậy nắp bằng giấy bạc, sau đó đem hấp khử trùng ở 1210C (1,5 atm) trong vòng 45 phút. Để nguội 55 - 600C trước khi rót ra đĩa petri đã khử trùng.
• Môi trường WA (Water Agar) Thành phần:
+Agar 20 g + Nước cất 1000 ml Cách điều chế: tương tự như môi trường PGA.
b. Phương pháp phân lập đất
• Phương pháp thu thập mẫu đất
- Lấy mẫu đất tại huyện Nam Đàn - Nghệ An: Chọn 5 xã có diện tích trồng lạc lớn, có địa thế đất, công thức luân canh, mật độ gieo trồng và điều kiện sinh thái đại diện cho vùng, mỗi xã thu thập 15 mẫu từ 15 ruộng có diện tích từ 300 – 500m2.
- Trên mỗi ruộng tiến hành lấy mẫu theo 5 điểm chéo góc, mỗi điểm 100g, trộn đều thành mẫu tổng hợp đem về phòng thí nghiệm và tiến hành phân lập đất để xác định sự tồn tại của nấm A.niger có trong mẫu.
• Phương pháp phân lập đất và giám định nấm Aspergillus niger trong đất
+ Phơi mẫu đất cho khô, dùng cối chày nghiền sơ đất (loại cối chày làm bằng đá dùng trong nấu bếp) và trộn đều.
+ Cho 10g mẫu đất vào một lọ có chứa 100ml WA 0,01% đã hấp tiệt trùng, tạo dung dịch 1:10.
+ Đổ 10ml dung dịch sang lọ thứ 2 chứa 90ml WA 0,01% tạo dung dịch 1:100 và lắc đều để đảm bảo đất được phân tán đều trong dung dịch. Lặp lại bước này để có dung dịch với nồng độ 1:1000.
+ Phân tán đều 1ml dung dịch đất trên bề mặt môi trường phân lập trong đĩa Petri đường kính 90mm:
- Chuẩn bị các đĩa môi trường phân lập và để khô trong vài ngày để loại bỏ hơi nước đọng trên bề mặt đĩa.
- Dùng pipette cẩn thận hút 1ml dung dịch đất cho vào một phía ở rìa của đĩa môi trường.
- Cầm đĩa hơi nghiêng từ mép có dung dịch và lắc nhẹ vuông góc với chiều dốc để dung dịch ướt đều trên bề mặt đĩa.
+ Đặt các đĩa phân lập này dưới ánh sáng trong 5 -7 ngày cho đến khi các tản nấm phát triển.
+ Tiến hành kiểm tra, giám định sự tồn tại của nấm A.niger trên các đĩa phân lập.
Hình 2.1. Sơ đồ phương pháp phân lập đất
Chỉ tiêu theo dõi: Tỉ lệ mẫu đất nhiễm nấm A.niger
TLMN (%) = Số mẫu nhiễm/ tổng số mẫu điều tra x 100
c. Phương pháp thu thập mẫu hạt giống lạc
Lấy mẫu hạt giống tại huyện Nam Đàn, tỉnh Nghệ An: Chọn 5 xã có diện tích trồng lạc lớn, có địa thế đất, công thức luân canh, mật độ gieo trồng và điều kiện sinh thái đại diện cho vùng, mỗi xã thu thập 09 mẫu từ 09 nông hộ. Mẫu thu được trộn theo xã, trộn tiếp theo huyện thành mẫu tổng hợp, lấy mẫu phân tích từ mẫu tổng hợp, lượng mẫu phân tích là 500 gam củ hoặc 300g hạt giống.
d. Phương pháp giám định bệnh hại trên hạt giống lạc
* Chúng tôi tiến hành thu thập các mẫu hạt giống của năm 2011 và tiến hành thí nghiệm vào vụ xuân 2012.
* Giám định nấm gây hại hạt giống theo tài liệu giám định bệnh hại hạt giống của Viện nghiên cứu bệnh hạt giống Đan Mạch (Mathur S.B và Olga K., 2001), kiểm tra nấm bệnh tồn tại trên hạt giống bằng phương pháp giấy thấm.
* Phương pháp chia mẫu: mẫu hạt giống được trải đều trên mặt phẳng theo hình tròn. Chia mặt phẳng làm 4 phần đều nhau. Lấy mỗi phần một lượng nhất định sau đó trộn đều sao cho đủ lượng mẫu kiểm tra. Lượng mẫu kiểm tra: 200 hạt.
* Phương pháp giám định bệnh hại trên hạt giống bằng phương pháp giấy thấm: Đặt 10 hạt trên giấy thấm đã được làm ẩm bằng nước cất vô trùng trong đĩa petri đã được khử trùng. Sau đó đặt chúng trong phòng ủ đảm bảo 12 giờ sáng, 12 giờ tối ở nhiệt độ 22 - 250C. Sau 7 ngày kiểm tra mẫu, soi hạt dưới kính lúp điện lần lượt từ vòng ngoài vào trong theo tâm đĩa, đối với những nấm chưa xác định rõ thì phải khều được bào tử nấm để soi dưới kính hiển vi, hoặc cho lên môi trường WA để làm thuần nấm, sau đó chuyển sang môi trường PGAđể quan sát tản nấm.
* Các chỉ tiêu theo dõi: TL bệnh, TL nảy mầm, TL mầm dị dạng, TL mầm bình thường.
e. Thử nghiệm một số dịch chiết thực vật trong việc ức chế nấm bệnh hại hạt giống lạc
* Dịch chiết so đũa
Phương pháp thu dịch chiết so đũa: đem nghiền nhỏ, vắt lấy dịch, sau đó pha loãng ra thành các nồng độ 5%, 10%, 15% và dùng ngay sau khi pha.
Ngâm hạt trong mỗi nồng độ dịch chiết ở các khoảng thời gian 5 phút, 10 phút và 15 phút, sau đó chắt dịch chiết, thấm khô hạt bằng giấy thấm đã được hấp vô trùng. Đặt hạt trên giấy thấm được phun ẩm bằng nước cất vô trùng để trong hộp petri, mỗi hộp petri đặt 10 hạt, sau 7 ngày kiểm tra theo phương pháp giám định bệnh hại hạt giống trên hạt.
Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên (CRD), gồm 4 công thức, mỗi công thức là 30 hạt, nhắc lại 4 lần, thử nghiệm trên giống L14.
+ Thí nghiệm với dịch chiết so đũa 5%
CT1: Đối chứng (ngâm hạt trong nước cất).
CT2: Ngâm hạt với dịch chiết so đũa ở nồng độ 5% trong 5 phút. CT3: Ngâm hạt với dịch chiết so đũa ở nồng độ 5% trong 10 phút. CT4: Ngâm hạt với dịch chiết so đũa ở nồng độ 5% trong 15 phút.
+ Thí nghiệm với dịch chiết so đũa 10%
CT1: Đối chứng (ngâm hạt trong nước cất).
CT2: Ngâm hạt với dịch chiết so đũa ở nồng độ 10% trong 5 phút. CT3: Ngâm hạt với dịch chiết so đũa ở nồng độ 10% trong 10 phút. CT4: Ngâm hạt với dịch chiết so đũa ở nồng độ 10% trong 15 phút.
+ Thí nghiệm với dịch chiết so đũa 15%
CT1: Đối chứng (ngâm hạt trong nước cất).
CT2: Ngâm hạt với dịch chiết so đũa ở nồng độ 15% trong 5 phút. CT3: Ngâm hạt với dịch chiết so đũa ở nồng độ 15% trong 10 phút. CT4: Ngâm hạt với dịch chiết so đũa ở nồng độ 15% trong 15 phút.
* Dịch chiết phi lao và dịch chiết bạch đàn:
Hình 2.3. Lá cây bạch đàn
Phương pháp thu dịch chiết bạch đàn: lá bạch đàn rửa sạch, cho vào máy nghiền nhỏ, vắt lấy dịch, sau đó pha loãng thành các nồng độ 5%, 10%, 15% và dùng ngay sau khi pha.
Hình 2.4. Lá cây phi lao
Phương pháp thu dịch chiết phi lao: Tương tự, lá và thân non phi lao rửa sạch, cho vào máy nghiền nhỏ, vắt lấy dịch, sau đó pha loãng thành các nồng độ 5%, 10%, 15% và dùng ngay sau khi pha.
Tiến hành thí nghiệm và bố trí các công thức tương tự như đối với dịch chiết so đũa.
Chỉ tiêu theo dõi: TL nảy mầm, TL mầm bình thường, TL mầm dị dạng và TL mầm và hạt nhiễm nấm.