Việc định lượng trong Q-PCR dựa trên sự phát huỳnh quang của sản phẩm PCR. Có nhiều phương pháp gắn huỳnh quang vào sản phẩm như sử dụng SYBR Green, sử dụng các đoạn dò đặc hiệu (đoạn dò Taqman, đoạn dò Beacon, đoạn dò lai …) [66].
♦ SYBR Green là một chất phát huỳnh quang khi gắn vào DNA sợi đôi. Trong phản ứng PCR, DNA polymerase khuếch đại DNA đích tạo nên sản phẩm là các DNA sợi đôi. Sản phẩm PCR càng nhiều thì cường độ huỳnh quang phát ra càng cao. Vì vậy, cường độ huỳnh quang tỉ lệ thuận với sản phẩm PCR tạo ra, đồng thời tỉ lệ thuận với lượng DNA đích ban đầu có trong mẫu thử nghiệm. Ưu điểm của SYBR Green là có thể sử dụng chung cho tất cả các loại thử nghiệm mà sản phẩm là DNA sợi đôi nên có giá thành thấp. Tuy nhiên vì là không đặc hiệu nên SYBR Green có thể gắn vào những sản phẩm không mong muốn.
♦ Đoạn dò Taqman là những oligonucleotide kích thước khoảng 24-30 đôi base, có trình tự bổ sung với một trình tự đặc hiệu trên DNA đích. Đoạn dò Taqman có đầu 5’ gắn chất phát huỳnh quang (gọi là reporter) và đầu 3’ có gắn chất hấp phụ tương ứng (gọi là quencher). Khi chưa có sự xuất hiện của sản phẩm thì đoạn dò Taqman vẫn còn nguyên vẹn nên huỳnh quang phát ra từ reporter sẽ bị quencher hấp phụ, do đó không có tín hiệu huỳnh quang phát ra từ phản ứng. Khi phản ứng PCR diễn ra, đoạn dò Taqman sẽ bắt cặp vào sợi khuôn của sản phẩm và sẽ bị Taq polymerase có mặt trong phản ứng PCR cắt bỏ để kéo dài mồi tổng hợp
nên sợi bổ sung. Lúc này đầu reporter bị cắt ra, rời xa đầu quencher nên reporter không còn bị ảnh hưởng của quencher và do đó reporter sẽ phát huỳnh quang khi nhận được nguồn sáng kích thích. Như vậy cường độ phát quang ứng với nồng độ sản phẩm PCR sau mỗi chu kỳ. Ưu điểm của đoạn dò Taqman là đặc hiệu với DNA đích và dễ thiết kế. Vì vậy, đoạn dò Taqman được sử dụng rất rộng rãi trong các phòng thí nghiệm có triển khai Real-time PCR.
♦ Đoạn dò Beacon là một oligonucleotide có kích thước từ 25-40 đôi base, đầu 5’ gắn với chất phát huỳnh quang (đầu R – reporter hay còn gọi là đầu F – Fluorophore) và đầu 3’ có gắn chất hấp phụ (đầu Q – Quencher). Đoạn dò Beacon được thiết kế có cấu trúc hình kẹp tóc (2 đầu đoạn dò có trình tự bổ sung với nhau). Khi không có mặt sản phẩm khuếch đại, đoạn dò Beacon tự bắt cặp thành cấu trúc kẹp tóc nên quencher sẽ hấp phụ hết ánh sáng của reporter. Khi có mặt sản phẩm khuếch đại ở giai đoạn nhiệt độ bắt cặp, đoạn dò Beacon bắt cặp vào sợi DNA đích nên quencher và reporter xa nhau, dẫn đến reporter phát ra huỳnh quang khi có nguồn sáng kích thích. Ưu điểm của đoạn dò Beacon là tính đặc hiệu cao nhưng nhược điểm là khó thiết kế.
1.3.3.3. Ứng dụng
Q-PCR thường được sử dụng để nghiên cứu các trình tự (DNA hay RNA) có số lượng bản sao rất thấp, không thể định lượng bằng các phương pháp lai phân tử cổ điển [8]. Q-PCR có thể ứng dụng trong các lĩnh vực:
♦ Bệnh nhiễm: định lượng virus (HIV, HBV, HCV …), định lượng vi khuẩn (Mycobacterium, Samonella, …), định lượng vi nấm (Candida, Cryptococcus, …) .
♦ Ung thư học lâm sàng: đánh giá sự tồn lưu ác tính, sự trao đổi đoạn của nhiễm sắc thể, các đột biến 1 nucleotide, …
Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU