- Tiến hành khảo sát các tổ hợp gien lần 1.
2.3.6.3.Khảo sát 4 tổ hợp gien trong BCCDL
6 MYH11-D2 5' CTT GAG CGC CTG CAT GTT 3'
2.3.6.3.Khảo sát 4 tổ hợp gien trong BCCDL
Hình 2.1 mô tả cấu trúc của các tổ hợp gien và vị trí các mồi trong BCCDL. Hai mồi xuôi nằm trên exon 13 của E2A và 2 mồi ngược nằm trên exon 2 của PBX1
(A) có thể phát hiện 2 kiểu bản sao của E2A/PBX1 [25], [85], [86]. Với 2 mồi xuôi nằm trên exon 8 của MLL và 2 mồi ngược nằm trên exon 8 và exon 7 của AF4 sẽ khuếch đại được tất cả các kiểu bản sao của MLL/AF4 (B) [94]. Sự kết hợp của 2 mồi ngược trên exon 3 của ABL với 2 mồi xuôi trên exon 1 của BCR hoặc 2 mồi xuôi trên exon 13 của BCR sẽ phát hiện tổ hợp gien ở vùng điểm gãy m-BCR (e1a2) hoặc M-BCR (b2a2, b3a2) tương ứng (C) [56], [126], [132], [133]. Hai mồi xuôi trên exon 5 của TEL và 2 mồi ngược trên exon 3 của AML1 sẽ phát hiện được cả 2 kiểu tổ hợp TEL/AML1 (D) [87], [134].
Exon 13 Exon 2 E2A PBX1 Centromere Telomere t(1;19)(q23;p13) A Exon 8 Exon 7 MLL AF4 Exon 8 Centromere Telomere t(4;11)(q21;q23) B Exon 1 Exon 3 BCR ABL t(9;22)(q34;q11) Exon 13 Exon 3 BCR ABL Centromere Telomere m-BCR M-BCR C Exon 5 Exon 3 TEL AML1 Centromere Telomere t(12;21)(p12;q22) D
Hình 2.1. Cấu trúc của các tổ hợp gien và vị trí các mồi
Thành phần phản ứng PCR gồm có 1 µL cDNA được trộn với 0,1 µL (0,5 U) iTaq Polymerase (Biorad), 1 µL (10 pmol) cặp mồi xuôi và ngược trong 20 µL hỗn hợp. Riêng đối với những tổ hợp gien cần được khảo sát qua hai giai đoạn thì phản ứng PCR lần thứ hai sử dụng 1 µL sản phẩm của phản ứng PCR lần thứ nhất làm mạch khuôn. Chu trình luân nhiệt cho phản ứng PCR khảo sát các tổ hợp gien lần lượt như sau 950C trong 2 phút; 40 chu kỳ với 950C trong 30 giây, 620C trong 1 phút; và cuối cùng là 720C trong 5 phút.
Riêng đối với tổ hợp gien E2A/PBX1, chu trình luân nhiệt cho phản ứng PCR lần lượt như sau 950C trong 2 phút; 40 chu kỳ với 950C trong 30 giây, 650C trong 30 giây, 720C trong 1 phút; và cuối cùng là 720C trong 5 phút.
Các chứng dương được sử dụng lần lượt tương ứng các tổ hợp gien
E2A/PBX1, MLL/AF4, BCR/ABL và TEL/AML1 là các dòng tế bào như SUP-B27, MV4-11, TOM-1, REH. Sản phẩm được giữ ở 40C đến khi lấy ra khỏi máy. Kết quả dương tính nếu như sản phẩm PCR có kích thước như trong bảng 2.2 [143].
Bảng 2.2. Thông tin các đoạn mồi khảo sát 4 tổ hợp gien trong BCCDL
STT Tên mồi Trình tự nucleotide Tên gien
và kích thước sản phẩm 1 TEL-C 5' AAG CCC ATC AAC CTC TCT CAT C 3' 2 AML1-D 5' TGG AAG GCG GCG TGA AGC 3' TEL/AML1
TEL exon 5/ AML1 exon 3: 298 bp và 259 bp 3 7700-F 5’ GAT GCT GAC CAA CTC GTG TGT G 3’ 4 7700-R 5’ TGG CCA CAA AAT CAT ACA GTG C 3’
Major BCR/ABL (7700)
Type b2a2: 212 bp Type b3a2: 278 bp
5 MB-A 1stF 5' CAA GGC TAC GGA GAG GC 3' 6 MB-A 1stR 5' ATG GTA CCA GGA GTG TTT CTC 3'
Major BCR/ABL
Type b2a2: 592 bp Type b3a2: 667 bp 7 MB-A 2ndF 5' GGA GCT GCA GAT GCT GAC C 3'
8 MB-A 2ndR 5' TTC CTT GGA GTT CCA ACG AGC 5'
Major BCR/ABL
Type b2a2: 154 bp Type b3a2: 229 bp 9 mB-A 2ndF 5' CAG TGC CAT
AAG CGG CAC C 3' 10 mB-A 2ndR 5' TTC CTT GGA GTT
CCA ACG AGC 3'
Minor BCR/ABL
198 bp
11 AF4-D 5' CGT TCC TTG CTG
AGA ATT TG 3'
12 MLL-E5 5' AAG CCC GTC
GAG GAA AAG 3'
MLL/AF4
Type exon 8/ exon 7: 270 bp Type exon 8/ exon 4: 439 bp (hiếm gặp)
Type exon 9/ exon 5: 468 bp Type exon 9/ exon 4: 513 bp (hiếm gặp) (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Type exon 10/ exon 6: 513 bp (hiếm gặp)
Type exon 10/ exon 5: 600 bp Type exon 10/ exon 4: 645 bp
13 E2A-A 5' CAC CAG CCT CAT
GCA CAA C 3'
14 PBX1-B 5' TCG CAG GAG ATT
CAT CAC G 3'
E2A/PBX1
E2A exon 13/ PBX1 exon 2: 372 bp