- Tiến hành khảo sát các tổ hợp gien lần 1.
2.3.7.2.Giai đoạn Split – out PCR
6 MYH11-D2 5' CTT GAG CGC CTG CAT GTT 3'
2.3.7.2.Giai đoạn Split – out PCR
Nếu kết quả dương tính ở giai đoạn master PCR thì tiếp tục chạy Split-out PCR tùy theo vị trí dương tính từ 1 đến 8. Mỗi phản ứng khuếch đại gien chỉ có một cặp mồi đặc hiệu nhằm mục đích chỉ nhận diện một tổ hợp gien đặc hiệu. Trường hợp này cũng cần thực hiện 2 lần phản ứng PCR. Phản ứng PCR lần thứ nhất sử dụng 5 µL cDNA; được trộn với 15 µL hỗn hợp gồm có Gotaq Flexi Polymerase (Promega), dNTP mix, PCR buffer, nước cất, 5 µL primer (PCR I Split out) trong 25 µL hỗn hợp. Phản ứng PCR lần thứ 2 sử dụng 1 µL sản phẩm của phản ứng PCR lần thứ nhất làm mạch khuôn, 5 µL Split-out primer (Thí dụ: M3A- PCRII đến M3D-PCRII) trong 25 µL hỗn hợp.
Chu trình luân nhiệt cho phản ứng PCR lần thứ nhất như sau: 950C trong 15 phút; 25 chu kỳ với 950C trong 30 giây, 580C trong 30 giây, 720C trong 1 phút 30 giây; giữ ở 40C cho đến khi lấy sản phẩm ra khỏi máy. Chu trình luân nhiệt cho phản ứng PCR lần thứ 2 như sau: 950C trong 15 phút; 20 chu kỳ với 950C trong 30 giây, 580C trong 30 giây, 720C trong 1 phút 30 giây; 720C trong 10 phút; giữ ở 40C cho đến khi lấy sản phẩm ra khỏi máy. Phản ứng PCR được thực hiện trên máy khuyếch đại trình tự gien iCycler (Biorad). Sản phẩm của phản ứng PCR lần thứ hai được điện di trên thạch 2% chứa 0,5 µg/mL ethidium bromide trong 0,5 x TBE. Kết quả dương tính nếu nhìn thấy băng qua ánh sáng UV, có kích thước phù hợp với băng của gien bất thường, theo qui trình của công ty (Phụ lục 5. Thông tin các tổ hợp gien phát hiện bằng Multiplex PCR).