- Tiến hành khảo sát các tổ hợp gien lần 1.
2.3.4. Ly trích RNA
Toàn bộ RNA được ly trích bằng cách sử dụng hóa chất Sepazol-I (Nacalai Tesque Inc., Nhật Bản) theo qui trình kỹ thuật do công ty cung cấp. Mẫu máu hay tủy bệnh nhân được cho vào ống nghiệm 50 mL, kế tiếp cho dung dịch ly giải hồng cầu (Red Blood Cell lysis buffer) đủ 50 mL, giữ trong thùng đá trong 1 phút, ly tâm
1.500 vòng/ phút ở 40C trong 5 phút. Sau khi ly tâm, hút bỏ lớp dịch trong ở trên, giữ cặn tế bào, thêm 25 mL dung dịch phân hủy hồng cầu, trộn đều, giữ trong thùng đá trong 1 phút, ly tâm 1.500 vòng/ phút ở 40C trong 5 phút. Sau đó, cặn tế bào được rửa sạch bằng dung dịch PBS(-). Cuối cùng, chuyển cặn tế bào vào ống nghiệm 1,5 mL, 107 tế bào cho mỗi ống nghiệm, thêm 980 µL Sepazol, trộn và giữ 5 phút ở nhiệt độ phòng; sau đó, trộn đều bằng ống tiêm 1 mL và kim 21 (hơn 10 lần), lưu trữ ở -800C.
Để ly trích RNA từ dung dịch Sepazol trên, cho thêm 200 µL Chloroform vào ống nghiệm, trộn kỹ và ủ 5 phút ở nhiệt độ phòng, kế tiếp ly tâm 15.000 vòng/ phút trong 15 phút ở 40C. Sau đó, chúng tôi chuyển phần dịch trong ở lớp trên vào ống nghiệm 1,5 mL mới, thêm 650 µL Isopropanol (2-Propanol) (Tỉ lệ 1:1), trộn kỹ, ủ 10 phút ở nhiệt độ phòng, rồi ly tâm 15.000 vòng/ phút trong 15 – 20 phút ở 40C. Phần tủa RNA được rửa sạch bằng 800 µL Ethanol 75% (70% - 80%), ly tâm 15.000 vòng/ phút trong 10 phút ở 40C. Cẩn thận hút bỏ dịch nổi, tránh để nước bám trên thành ống nghiệm, để khô tự nhiên ở nhiệt độ phòng. Tất cả các bước đều được thực hiện trong buồng xử lý vô trùng. RNA được hòa tan với 20 µL dung dịch DEPC cất giữ ở -800C cho đến khi sử dụng.
Riêng đối với kỹ thuật RQ-PCR, cần tiến hành đo nồng độ RNA bằng máy Ultrospec 5300 pro. Mẫu đạt chất lượng khi có OD260:OD280 = 1,8 – 2,0. Lấy lượng thể tích mẫu chứa đúng 1µg RNA để tổng hợp cDNA nhằm đảm bảo sự đồng nhất đầu vào của các mẫu cần định lượng. Lượng RNA còn lại được lưu trữ ở nhiệt độ -800C.