- Tiến hành khảo sát các tổ hợp gien lần 1.
2.3.7.1.Giai đoạn Master PCR
6 MYH11-D2 5' CTT GAG CGC CTG CAT GTT 3'
2.3.7.1.Giai đoạn Master PCR
Để phát hiện các gien bất thường, cần thực hiện 2 lần phản ứng PCR, với 8 phản ứng khuếch đại gien song song, theo qui trình kỹ thuật của Hemavision Full kit (DNA Technology A/S, Đan Mạch). Phản ứng PCR lần thứ nhất sử dụng 5 µL cDNA; được trộn với 20 µL hỗn hợp gồm có: Gotaq Flexi Polymerase (Promega), Master primer M1-PCRI đến M8-PCRI, dNTP mix, PCR buffer, nước cất. Phản ứng PCR lần thứ 2 sử dụng 1 µL sản phẩm của phản ứng PCR lần thứ nhất làm mạch khuôn, với mồi từ M1-PCRII đến M8-PCRII trong 24 µL hỗn hợp Master mix.
Mỗi phản ứng PCR gồm có các bước sau: duỗi mạch cDNA, gắn kết cặp mồi vào cDNA, tổng hợp đoạn cDNA mới. Chu trình luân nhiệt cho phản ứng PCR lần thứ nhất như sau: 950C trong 15 phút; 25 chu kỳ với 950C trong 30 giây, 580C trong 30 giây, 720C trong 1 phút 30 giây; giữ ở 40C cho đến khi lấy sản phẩm ra khỏi máy. Chu trình luân nhiệt cho phản ứng PCR lần thứ 2 như sau: 950C trong 15 phút; 20 chu kỳ với 950C trong 30 giây, 580C trong 30 giây, 720C trong 1 phút 30 giây; 720C trong 10 phút; giữ ở 40C cho đến khi lấy sản phẩm ra khỏi máy. Phản ứng PCR được thực hiện trên máy luân nhiệt iCycler (Biorad). Sản phẩm của phản ứng PCR lần thứ hai được điện di trên thạch 2% chứa 0,5 µg/mL ethidium bromide trong 0,5 x TBE. Kết quả dương tính nếu nhìn thấy băng qua ánh sáng UV, ở vị trí từ M1 đến M8, quyết định nhóm cần thực hiện Split-out PCR tương ứng từ 1 đến 8.