2. đỐI TƯỢNG, NỘI DUNG, VẬT LIỆU, PHƯƠNG PHÁP
2.4.4.Phương pháp PCR Ờ xác ựịnh ựặc tắnh gene học
PCR là phương pháp dùng enzym khuyếch ựại chọn lọc một ựoạn ADN theo luật số mũ. Phản ứng nhân gene ựược thực hiện với DNApolymerase, hai mồi tổng hợp và 4 loại deoxyribonucleic (dATP, dGTP, dCTP và dTTP).
Các bước tiến hành:
- Tách DNA của vi khuẩn: Canh khuẩn nuôi cấy 37OC/16-18h, lắc 220 vòng/phút. Chuyển vào ống Eppendorf 200ộl canh khuẩn, ly tâm 3000 vòng/phút trong 3 phút ở 4OC, hút bỏ dịch phắa trên, hòa tan phần cặn vi khuẩn trong 200ộl H2O 2x. đun cách thủy 100OC trong 5 phút. Lập tức chuyển ống chứa vi khuẩn ựã ựun vào trong ựá lạnh, giữ trong 3 phút. Ly tâm 12.000 vòng/phút trong 3 phút ở 40C. Giữ trên ựá lạnh, dịch trong chứa DNA dùng làm sợi mẹ trong PCR.
- Chuẩn bị mồi: Sử dụng các cặp mồi do Invitrogene cung cấp, trình tự nucleotide các cặp mồi trong bảng 2.1.
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ.. 28
Bảng 2.1. Trình tự nucleotid các cặp mồi sử dụng trong PCR Gene ựắch Trình tự chuỗi oligo (5′-3′) Kắch cỡ sản phẩm (bp)
F4 GCA CAT GCC TGG ATG ACT GGTG CGT CCG CAG AAG TAA CCC ACCT
499
F5 AAT ACT TGT TCA GGG AGA AA AAC TTT GTG GTT AAC TTC CT
230
F6 AAG TTA CTG CCA GTC TAT GC AAC TTT GTG GTT AAC TTC CT
409
F18 GTG AAA AGA CTA GTG TTT ATT TC CTT GTA AGT AAC CGC GTA AGC
510
LT AAT TAC GGA GTT ACT ACT CTC TTT TGG TCT CGG TAC GAT AGT
272
STa TCC GTG AAA CAA CAT GAC GG ATA ACA TCC AGC ACA GGC AG
158
STb GCC TAT GCA TCT ACA CAA TC TGA GAA ATG GAC AAT GTC CG
133
VT2e CTT CGG TAT CCT ATT CCC GG
CTG CTG TGA CAG TGA CAA AAC GC
516
- Chuẩn bị các thành phần của phản ứng PCR: Trên ựá lạnh, cho tuần tự các chất và dung lượng ở bảng 2.2 vào ống PCR.
Bảng 2.2. Thành phần phản ứng PCR
TT Thành phần phản ứng Nồng ựộ Thể tắch (ộ)
1 Dnase-, Rnase Ờ Free water Cat#P119, Promega 6
2 Sợi mẹ DNA 2,5
3 Mồi xuôi (các loại) 2
4 Mồi ngược (các loại) 2
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ.. 29
Tổng 25
Chạy máy PCR theo chương trình và chu trình nhiệt tùy gene ựắch, theo chương trình ở bảng 2.3.
Bảng 2.3. Chu trình nhiệt của PCR
Giai ựoạn Bước Tên Nhiệt ựộ Thời gian (phút) Số chu kỳ
A 1 Biến tắnh 940C 10 1 1 Biến tắnh 940C 1 550C (F4, STa, STb, LT) 2 Gắn mồi 51,50C (F5, F6, F18, Stx2e) 1 B 3 Tổng hợp chuỗi 720C 1 30 C 1 Tổng hợp chuỗi 720C 10 1 D 1 Dừng 40C đến nhỏ gel 1
- điện di sản phẩm PCR trên gel Agarose: - Kiểm tra sản phẩm PCR trên ựèn UV, chụp ảnh.
Trên ảnh chụp nền ựen, các ựoạn DNA sản phẩm PCR hiển thị ở dạng băng màu trắng. Kắch thước các băng ựược xác ựịnh bằng cách so sánh với DNA marker.