c. Các bước tiến hành
3.5.6Phương pháp làm tiêu bản vi thể:
* Lấy mẫu: sau khi mổ khám xong, lấy mẫu các tổ chức: gan, não, lách, phổi, ruộtẦmẫu ựược cắt thành những miếng nhỏ hình chữ nhật hoặc tam giác sao cho tiết diện ựủ cả phần trong và ngoài tổ chức, cho vào bình chứa ựựng dung dịch Formol 10% (thể tắch Formol gấp 9 lần thể tắch bệnh phẩm), với tổ chức nổi (phổi) dùng gạc phủ lên trên.
* Làm tiêu bản vi thể:
- Lấy các miếng tổ chức cố ựịnh trong Formalin ra cắt mỏng 2-3mm, rửa dưới vòi nước chảy trong 2-3 giờ.
- Chuyển sang ngâm trong cồn 70% trong 2-3 giờ. - Ngâm sang cồn 90% trong 2-3 giờ.
- Ngâm sang cồn tuyệt ựối 2-3 giờ. - Ngâm sang Xylen 1 ựể trong 2-3 giờ. - Ngâm sang Xylen 2 ựể trong 2-3 giờ.
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ. 48
- đúc khuôn. - Cắt tiêu bản:
+ Cắt gọt khối block vuông, mặt cắt bằng phẳng, ựể trên mặt khay ựá. + đặt mặt khối block song song với mép lưỡi dao, cắt chiều dày lát cắt 2-5ộm.
+ Chọn lát cắt tiêu bản phẳng thả vào nồi chưng cất nhiệt ựộ nước 30- 35ồC, Dùng lam kắnh vớt dán lát cắt bằng albumin (lòng trắng trứng gà) rồi ựể khô.
- Nhuộm tiêu bản H&E
+ Tẩy Paraffin trong Xylen 3 lần, mỗi lần 3-5 phút. + Ngâm trong cồn tuyệt ựối 3-5 phút.
+ Ngâm sang cồn 90% ựể 3-5 phút. + Ngân sang cồn 70% ựể 3-5 phút. + Rửa dưới vòi nước chảy 3-5 phút.
+ Ngâm trong thuốc nhuộm Haematoxylin 1-2 phút tuỳ theo chất lượng của thuốc nhuộm và ựộ dày của tiêu bản. Sau khi nhuộm xong phải kiểm tra, nếu tiêu bản bắt màu nhạt có thể nhúng nhanh tiêu bản qua dung dịch NaHCO3 1% ựể tiêu bản ựậm hơn, nếu tiêu bản ựậm có thể nhúng nhanh qua cồn axắt Clohydric (1 phần HCl Ờ 99 phần cồn Ethylic). Sau khi ựiều chỉnh màu, rửa sạch tiêu bản bằng nước cất.
+ Rửa dưới vòi nước chảy 3-5 phút.
+ Ngâm trong thuốc nhuộm Eosin 60-90 giây tuỳ theo chất lượng của thuốc nhuộm và ựộ dày của tiêu bản. Nếu màu Eosin nhạt có thể cho vào dung dịch thuốc nhuộm Eosin 1-2 giọt axắt Axetic.
+ để khô trong nhiệt ựộ phòng (hoặc ngâm trong cồn 90% và cồn tuyệt ựối), chuyển sang Xylen 2 lần ( mỗi lần 2-3 phút), gắn lamen bằng Balm canada. để khô, soi kắnh.
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ. 49
+ Soi kiểm tra dưới kắnh hiển vi: từ vật kắnh có ựộ phóng ựại thấp ựến vật kắnh có ựộ phóng ựại cao (từ 100 lần ựến 400 lần).
Mỗi cơ quan, chúng tôi tiến hành làm 2 block, mỗi block chúng tôi chọn 3 tiêu bản ựẹp ựể quan sát. Như vậy mỗi con lợn bệnh chúng tôi nghiên cứu trên ắt nhất là 30 tiêu bản. Các tổn thương vi thể ựược quan sát trên tiêu bản bằng kắnh hiển vi quang học ở các ựộ phóng ựại khác nhau.
đánh giá mức ựộ biểu hiện tổn thương vi thể theo thang ựiểm 4 bậc ựối với mỗi block (mỗi block làm 3 tiêu bản):
- Tất cả số tiêu bản nghiên cứu không có tổn thương: âm tắnh (-) - 1 tiêu bản có tổn thương: dương tắnh yếu (+)
- 2 tiêu bản có tổn thương: dương tắnh ựiển hình (++)
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ. 50